CDP用于体外转染

CDP用于体外转染

材料

试剂

待 输 送 材 料

可能的材料包括20ug哺乳动物绿色荧光蛋白表达质粒（如 pEGFP; Clontech)、 20ugFITC标记葡聚糖（平均分子质量3000〜 10 000; Molecular Probes)、 20ug F IT C 标记聚苯乙稀珠 子（直径 IOOum 或 40nm; FluoSpheres， Molecular Probes)、 20ug 纯化 GFP 或 lm m ol/L韩黄绿素（Sigma-Aldrich)。

阴 性 对 照 细 胞（非 人 源 或 非 肝 源 ，如 Wi D r ， A 431)

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S ) (见 Sambrook and Russel 2001)

纯 化 的 B N C 溶 液

Kuroda 等在 1992 年（ Kuroda et al. 1992) 报道了 HBV 外壳 L 蛋白在 >Sacc/zaroW3^s cere-Visiae 细胞 AH22R-中表PGLDLIIP39-RCT 的方法，在可溶性蛋白质中， BN C 含量大约为 40% (m / m) 。起速离心纯化 B N C 的方法参考 Yamada 等（2001)。溶 液（200〜300ug蛋白质/ m lp B S ) 经消毒 0 . 4 5 um 滤膜过滤， 4℃保存。反复冻融会破坏 BNC 结构。

细 胞 系 ：人 肝 来 源 细 胞 系（如 H e p G 2 、 H u H -7、 N u E )

异 种 移 植 老 鼠 模 型 ：移 植 癌 细 胞（N u E 和 W i D r , 肿 瘤 直 径 约 l c m ) 的 B A L B /c 裸鼠（nu/n u , 10〜 I i 周 龄 ，雄 性）

电穿孔管（4m m )

电穿孔系统 （G e n e Pulser II， Bio-R a d )

荧光显微镜

方 法

BNC 装载待输送材料

1•将待装载 B N C 的材料与纯化的 B N C (l( % g 蛋白质）用 5 ( % 1 的 P B S 混合。

2•将混合液转移到 t o m 的电穿孔管，施 加 220V 和 9 5 0 # 约 220m s 。

未装载人 BNC 的材料不必除去。

BNC 的体内体外实验

3.将上述制备的 B N C 直接加入培养的 5 X I O ⁴ 个人肝来源细胞中，培养基含 1 0 % 胎牛血清。当输送 D N A 时，加 人 IOOng B N C ，其中含 20n g 质 粒 D N A 。转 染 3d 后 ，用
荧光显微镜观察 G F P 的表达。当 用 B N C 输 送 非 D N A 材料时，用电穿孔处理的B N C (小于 IOUg), I d 后观察变光。

BNC 的体内实验

4.将含有质粒或非 D N A 材料经电穿孔处理的 B N C 通过尾静脉注射到接种肿瘤的小鼠。3〜7d 后 ，观察肿瘤组织中的荧光。