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PCR 扩增 SSLP 用于自动荧光分型实验

相关实验:自动荧光的分型实验

最新修订时间:

材料与仪器

DNA 样本
4dNTP 混合液 MgCl2 荧光染料标记的每个微卫星标记的正向引物 每个微卫星标记的正向引物 Taq DNA 聚合酶
96孔板 烤干炉 多道排管吸液器和消毒的试剂盘 96孔塑料封膜 5ml 和 50ml 的管子 热循环仪

步骤

1. 在一个96孔板中按需要的顺序排列4ng/jul的患者D N A 样 本 ( 如将家系的成员放在 一组这样可以在同样的胶上显示) 。排列样本从列的A l 到 H 1,从行1〜12以方便胶 上样。 . 2. 每个患者D N A (20ng) 吸取5^1到恰当的孔中,根据需要扩增的标记数来重复。 短 期 的 保 存 可 以 盖 上 板 子 或 者 应 密 封 放 冰 箱 里 ,保 存 几 天 。 长 期 保 存 时 在 70〇 C 烤 炉 里 15〜 30m i n 烤 干 D N A , 室 温 下 保 存 。 P C R 前 于 95°C 10m i n 再 水 化 。 3. 为每个引物特异性的反应混合液标记5m l 的管子,为减去引物的其他主要的反应混 合液标记一个50m l 的管子。所有的管子上标记包括MgCl2 的浓度和引物的名字。 4. ^Oml的管子里,为所有的板子准备除了引物的主要的反应混合液。将板子和所有的 成分置于冰上,每个板子加入下面的成分( 基于110个反应/板子,允许损失) : 22 〇410义 ? 0 ^ 缓 冲 液 ; 22〇 y 10mmol/L 4dNTP 混合液; 220/^1 25mmol/L MgCl2; 22〇 W 5U / 4 金牌Ampli T 叫 D N A 聚合酶; 7154 H 2O (或者12654如果板子上是烤干的D N A 的话)
总容量= 1595jul/板 子 ( 或 者 14, 5^x1/个反应) 。 这个反应混合液是假定所有的■引物需要2. 5m m o l / L M g C l 2,但 是 MgCl2可能需 要优化,如 果 引 物 需 要 的 MgClz不同,主要的反应混合液就 必 须 单 独 配 制 。任 何 MgCl2的改变都通过调整水的量来补充。 5 . 将 1 595W的主要反应混合液分装到每一个5m!的管子里,每个管子里加27 5^的 恰 当 的荧光标记的正向引物和27. 5^1的恰当的反向引物,配成引物特异性的PCR混合 根据需要来保持引物处于解冻状态,将引物放置于冰盒里,盖上盖子防^焚°光 标记受热散失。 6 . 将引物特异性的PCR混合液吸入一个多道吸液器试剂盘里,用引物对扩增的标记的 名 字 标 记 % 孔 板 ,如 D2S126。从每个引物特异性的混合液里吸去I 5fjj (如果板子 是烤干的话吸20jul) 到恰当的包含有要分型的D N A 的 9 6 孔板中。 7 . 板子样本加好后,盖上盖子或者用密封膜封好,放入热循环仪 。 根 据 引物的情况执 行正确的程序。 激 活 : 12min 95〇C 1 6 个循环: 30s 94〇C 30s 66°C ,每个循环降低r c 30s 720C 2 2 个循环: 30s 94〇C 30s 50°C 30s 72〇C 最后一^步: 无限期 4°C 在 第 一 个 1 6 个循环里退火温度从66°C降 到 50°C以给大多数的产物提供—个可 选的♦ 广增条件,然后继续扩增达到一 定水平使能在股上检测出来。对于每个引物对 DNA模板和热循环来说, P C R 条件,特别是扩增的温度都是需要优化 的 。 8•将P C R 产物放于冰上,准备 P C R 产物混合物( 支持方案1),或者将P C R 产物根据 需 要 放于冰箱( 只用于保存P C R 产物)内。在丙烯酰胺胶上跑p C R 产物混合物 (支持方案2)。

支持方案1 混合用于基因分型的荧光标记的 PCR 产物

多重反应组里每个标记的数量是根据在琼脂糖胶上检测每个位点的pC R 产物的检 测结果来决定的。从每个板中最少取两个样本用于分析。 材料 荧光标记的P C R 产 物 ( 基本方案) 4X B B 载样染料: 0.167% (m A 〇 溴酚蓝/30% ( V A O 甘油 SOjug/ml DNA 分 子 质 量 标 记 ( 如 DNA Mass Ladder、 Life Technologies) Genescan 500 Tamra (Perkin-Elmer) 用于% 孔板的Beckman CS-6离心机和PTS-2000振 荡 仪 ( 或者相同功能的苴他仪 器)
96孔板 多道移液器 96孔塑料板密封膜( Costar) 90°C烤炉 1. 如果荧光标记的PCR产物板是冷冻保存的且有凝块贴在盖子上或者封口膜上则须用 带 96孔板套板的Beckman CS-6离心机室温下离心几秒钟,使凝块回到管中。 2 . 切一片大约4 c m X 2 0 c m 的石蜡膜,为上样的每个样本点2 4 4 X B B 载样染液在石蜡 膜上。从阴性和阳性对照孔中吸8M P C R 产物到相应的2|u U X B B 点上,上样前混 合每个样本,每行琼脂糖胶点一道5jul的 5(Vg/ml D N A 分子质量标记。 3. 2 % 琼脂糖胶上样IOjlJ 包 括 〇.2m g /m l 的 溴 化 乙 键 ( 附 录 3G )。 90m V ,跑 胶 20m i n 直到带大约跑到胶的一半停止。 4 . 胶照相以确定带的亮度( 带越亮, PCR反应越强,产物越多) ,根据板子上样本引物 的名字标记照片。 5. 检查组里荧光染料标记的每个m a r k e r, 以决定用在表2.3. 1 里显示的每种染料混合 的量,调整产物的量到正好反映琼脂糖胶的结果。按混合量从低到高排列P C R 产物 以分组。如果 P C R 产物板在上样和混合之间是在冰箱里保存的,则 800^离 心 。 每个微卫星标记的引物都是特异性的染料标记的, '引 物 可 以 被 1〜3 种染料: Fam (6-友基焚光素) 、 Hex (4, 7, 2 , 4 , 5', 7’-穴氣焚光素-6-嚴基荧光素)或 者 Tet (4, 7, 2', 7'-四氯荧光素-6-羧基焚光素)标记。这些染料的亮度不同, H e x 大约是F a m 或 T e t 亮度的一半。需要一些预实验来决定混合的量,可以 根 据 所用的 仪器变化。混合太多的产物将导致胶超载,混合太少的量将导致太少的信号。在 A B I 的仪器上P C R 产物的荧光范围可以为200〜2000个荧光单位
7. 对于混合的板子,根据每个孔的最终量是2004加一定量的水。用多道的移液器, 从每个PCR产物的板子( 每个标记)转移合适的量到混合的板子。当转 移 完 有 的 marker,混合板子的每个孔。 见 表 2.3.2 ,假 足 混 合 9 个 分 子 标 记 的 组 ,在 这 个 例 子 里 ,所 有 跑 股 了 的 标 记 总 P C R 产 物 是 〇.47|ul,不 能 超 过 2pl, 因 为 过 量 的 P C R 盐 会 干 扰 电 泳 。 8. 从混合的板子中转移2^1到跑胶的板子中,如果稍后再上样跑胶,则用密封膜密封 跑股的板子,放冰箱里。如果同一天上样,执 行第 9 步前配置好跑胶装置( 支持方 案 2)。冰箱里保存每个标记的PCR产物直到胶上的分型数据被成功收集以防 重复。 9. 加 ImI 的 Genescan 500 Tamra分子大小标准到每个要上样的孔中。用密封膜密封板 子 ,室温下800g 离心板子几秒,以去除孔中的气泡。 10. 在 90°C烤炉中加热5min (长时间可能会导致板子融化) ,加热后,立即放于冰上冷 却样本。执 行 电 泳 ( 支持方案2)

支持方案2 混合好的 PCR 产物电泳


1.打开测序仪和电脑。

2.把6%24 cmweU-to-read丙婦酰胺胶的夹子去掉,将多余的胶用水冲洗干净,把玻璃板上灰尘弹掉。缓慢地移去梳子,用水冲洗掉多余的丙烯酰胺胶。晾干玻璃板或者在干净的Kimwipe中烤干玻璃板。

对于一个 96 孔需上样的板子,下面描述的过程使用的是3个32 孔的肢,2个48孔的胶同样可以使用。

3.打开自动测序仪前面舱的门,把低的缓冲液槽子装在舱的下面,将一个干净的胶放在舱里,使其平面正好对着激光室,胶板的底部放在低的槽子的对面。确保胶的方向是正确的,有耳的一面向里。

4.看一下胶扫描的区域是否有黏着在板子上的胶碎片,如果需要,用一块潮湿的Kim_wipe将其擦干净。用黑色的间隔片将胶锁在正确的位置,关上舱门。

5.调整光电倍增管(PMT) 的电压,用373A 键区,选择MainMenu, 选Calibration, 然后选Configure核查运行的参数。检查默认的参数,如果需要可进行修改。

运行时间:5 h30 min1070V

出现数据通信的错误时运行不会终止

滤过器轮B

激光功率是40mA/30 mW

6.鼠标和键盘在Genescan672收集软件的菜单窗口中选择Scan和Map,在 373A主菜单上用主键区选择StartPre-run然后PlateCheck。选择FullScan 开始扫描胶板。

如果读般的区域是干净的,扫描将会看起来像平线,在胶的宽面的图将会全是灰色。如果扫描有明显的峰和图上有有颜色的蜂,那是在玻璃板的激光读数的区域有碎胶或灰尘。这时必须打开电泳舱,将玻璃板的两面都擦干净。用潮湿的Kim一wipe擦时最好从水平方向擦拭。重新按照以上描述检查胶是否干净,如果需要重复擦拭直到胶读数的区域是干净的。

扫描如显示一个峰包括4种颜色,这是由于胶的不规则造成的,这是不能够被擦干净的。然而,随着缓冲液在胶里跑这个问题会自动消失^如果遇到这样奇怪的峰,注意扫描窗口峰的X轴,这个值和信道数是等同的,可以用于决定哪一道人造峰将被显示二根^信道值决定36孔梳子的道数,如果胶不规则则在上样时跳过这道。

7.用鼠标指示扫描的最低的颜色行,扫描的左下角是1轴和^轴的坐标。检查最下面一行3^轴的PMT值。

y值应该在800的2〇个单位内,3;值是根据373A键区里设置菜单的PMT的值调f的。设置菜单可通过主菜单里的 Caiibration达到。升高pMT值亦升高^值。

8.重复第2~7步直到每个胶板都在电泳舱上装置好,都是干净的扫描区域和正确的PMT值。

9.通过旋转螺旋夹直到垫圈变平和用手旋紧夹子将上面的缓冲液槽安到安全的玻璃板上。加IXTBE电泳缓冲液到上面的缓冲液槽,小心操作勿将缓冲液滴到读数的区域否则要再擦干净并重新扫描。用IXTBE缓冲液灌上面的缓冲液槽直到高于最高的孔大约0.5 cm和距最上面的舱大约lcm,灌下面的缓冲液槽直到距离槽的顶大约1 cm。确保下面舱的电线是覆盖着的,检查上面缓冲液槽的垫圈是否密封好。

每台仪器大约需要I.5L的1 X TBE。

10.用一个60 ml的注射器,用1 x TBE 冲洗胶孔。把针头的顶部正好放在上面的缓冲液槽的两块玻璃板之间。

11.芒果需要,将一个塑料的指示带放到玻璃板的外面,这样相应的胶孔的顺序可以显示。检查胶是否有断掉的孔沿、气泡或者坏的胶孔。注意如果有任何胶孔有这些问题都不能上样。

12.将要上样的板子放在冰盒里,将开始 4 列(A1~A4)的塑料封条扯掉。将微量移液器调到知 1,在孔 Al 里吸取样本,将 tip 的平面放到两块玻璃板之间,大概—半伸入第一个胶孔里,缓慢的将样本打入胶孔,拔出 tip。小心胶孔别太满,防止样本流入下一个胶孔里。如果相邻的胶孔污染了,则跳过它,做个标记。

13.继续从上样板里吸取样本上样,直到 Hl 孔,然后移到下一列从 A2孔到 H2 孑 L。

将板子的前 4 列上到前三块胶,如果胶上样错了,要在胶孔上注明上错的那—道。

14.当胶全部上样完了,把塑料指示带从玻璃板上取下,插上上面和下面缓冲液槽子的电源,关上电泳舱的门。在373A 的测序键区,按下 ChooseRim 按钮,选择 GenescanRun开始电泳,立即用鼠标指示绿色的Coliect 按钮开始 Genescan 收集。.

Collect 按钮将开始闪烁以核实收集开始,如果绿色的按钮没有开始闪烁,按下 373A键区的 StopRun 按钮,从有经验的人那里得到帮助。

15.重复第 9~14 步将 A4~H8 和 A9~H12 上样到另外两块胶上,当所有的三个仪器全部上样完成、Genescan 收集开始时,最后检查收集的按钮是否闪烁。当跑胶完成时,检查错误。

Genescan 在收集过程中不应该有任何的错误,373 键区应该显示执行时间用了 5.5 h。

16.关掉 373A 测序仪,打开电泳舱的门,拿住胶板,上缓冲液槽仍在上面,仍是对着激光室,打开两边的插销将黑色的带子从胶丄撕掉。将胶和上缓冲液槽一起拿出电泳舱,拿到水槽处倒掉缓冲液,将上缓冲液槽从胶上取下。

17.小心地将下缓冲液槽从电泳舱里取出倒掉缓冲液,冲洗两个槽子后放到测序仪下面。用潮湿的纸巾将电泳舱内洒的液体擦干净,关上电泳舱的门,其他的胶板重复此步骤。

18.分析股,根据生产厂家的说明书用 Genescan Analysis 和 Genotyper 软件分析等位基因型。

来源:丁香实验

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