用ReadyMixTM PCR Reaction Mix进行拟南芥SSLP

用ReadyMix TM PCR Reaction Mix 进行拟南芥SSLP （32 个样品+3 个对照）

一、PCR

采用SIGMA REDTaq® ReadyMixTM PCR Reaction Mix提供的 试剂 （包括20 mM Tris-HCl, pH 8.3, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.002% gelatin, 0.4 M dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), stabilizers, 0.06 unit/µl Taq DNA Polymerase）。

用CER456772 SSLP Marker, Col 348 bp, Ler 291 bp. All primer stocks: 100 µM. 90 µl H2O + 10 µl primer stocks = 10 µM primer.

32 Samples + 2 Col DNA + 2 Ler DNA + 2 F1 (Col×Ler) DNA: 38 PCR Reactions.

PCR每一管中应加入：

2 µl DNA Template

2 µl H ₂ O

0.5 µl CER456772 Forward primer 10 µM

0.5 µl CER456772 Reverse primer 10 µM

5 µl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

共10 µl

PCR条件（保存为BOBBY）：

94℃, 4 min。94℃, 15 s；55℃, 15 s；72℃, 30 s。循环40次（调PCR仪时调39次）。

另外，有人喜欢72℃, 3 min。可不用。

1、吸取Sample（DNA Template）2 µl到新的PCR管中，然后将除DNA Template 外的上述溶液混合配成Premix，意味着每一管中加入8 µl Premix。对C、LER、F1及32个Sample进行PCR，Premix总共应配40 ×8 µl = 320 µl（为保险起见，多配2封16 µl），即在一新的大管中加入如下溶液混合：

2 µl × 40 = 80 µl H2O

0.5 µl × 40 = 20 µl CER456772 Forward primer 10 µM

0.5 µl × 40 = 20 µl CER456772 Reverse primer 10 µM

5 µl × 40 = 200 µl ReadyMixTM PCR Reaction Mix

注意Primer Stcoks浓度为100 µM，用前可稀释。混合前后应进行振摇和离心（到达6000 rpm）。

2、在已放入Sample（DNA Template）和对照2 µl到新的PCR管中各加入8 µl Premix，反复抽吸混匀。然后进行PCR反应。

二、DNA电泳

DNA电泳槽中号为120 ml。通常跑100 bp-200 bp（多或少10 bp-20 bp）长DNA用琼脂糖浓度为3-4%的胶，200 bp-400 bp长DNA用琼脂糖浓度为2.5%的胶。2.5%意味着2.5 g/100 ml。用DNA中号电泳槽所需琼脂糖为120 ml ×2.5% = 3 g。

100 bp DNA Ladder可确定100-1500 bp长的双链DNA。

1、首先称量3 g琼脂糖，然后加120 ml 0.5×TBE缓冲液，称量其重量。

2、用微波炉加热融化，直至看不到琼脂糖颗粒，然后再称重，加水至原加热前重量。

3、用胶布构建倒胶槽，在融化的琼脂糖溶液中加5 µl SYBR SAFETM DNA gel stain，混匀。

4、待琼脂糖冷至60℃后，倒入制胶槽，让其在室温下冷却。

5、除去胶布，将制胶槽放入电泳槽，加0.5×TBE缓冲液至淹没琼脂糖凝胶，高于胶面1 cm。

6、取DNA Ladder（6 µl）及经PCR扩增的对照和样品（10 µl）点样。中型 电泳仪 将电压调整到100 V，开始电泳。

7、约45-60 min后，关闭 电泳仪 。取胶槽拍照，记录。