用PCR进行基因分型

与许多一次做数百块Southern blots的研究人员一样，我第一次用PCR做基因分型（genotyping）时觉得见效很快，不再需要等几天才能看到结果，不再需要DNA显微图像或者操作紫外线了。随着技术的不断进步，RCR使基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化，甚至随着免疫PCR的普及开始进军蛋白组学。

目前有许多以RNA为基础的基因分型技术，有些只是名称不同，简单到只是跑块胶，有些很复杂，需要检测单核苷酸多态性的累积。选择哪种方法当然依据需要而定，但这里对某些以PCR为基础的基因分型分析的优点和缺点做了一个简要总结。下标列出了一些常见的系统和平台及其详细特征。

<font>The Simple Acronyms</font>

最基本的设计是序列特异引物（sequence-specific primers ，SSP ）或称等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension ，ASPE）、序列特异性寡核苷酸探针（sequence-specific oligonucleotide probes，SSOP）或等位基因特异性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotides ，ASO）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。进行低通量研究时，这些分析不需要特异仪器。

一般情况下，SSP中变的异体专一引物所检测的特异突变或者是positive 或者是negative；在SSOP中，将标记过的扩增子（amplicon）绑定在位于杂交斑点上的变异体专一探针，检测突变；RFLP中，用限制性内源性降解PCR产物，通过观察切开或者未切开片段，得到结果。尽管突变的位点对SSP设计引物有限制，但SSOP和RFLP为引物设计带来了很大弹性，引物可以在任何地点，尝到甚至可以跨越突变。

我还发现RFLP（又称扩增片段长度多态性，amplified fragment length polymorphism，AFLP）得到明确结果，鉴别突变有合适和和便宜的核酸内切酶。加入标记过的引物，大多数遗传分析仪可推算片段长度。问题在于它需要post-PCR操作，意味着污染的风险，而且也不适合高通量研究。

对于大项目，所有三种方法都很昂贵和耗时，但因为大多数自动化方法要求扩增小片段，基本的设计是分析大片段的唯一选择。而且，有旁向性同源基因（paralogs）的基因需要具有位点特异性的引物。假如目的突变和位点特异的引物相距较远，基本方法是必需的。

<font>熔解曲线法</font>

DNA的碱基组成影响变性温度。利用特异荧光染料或者标记探针的高分辨率熔解点分析能够在PCR（标准设备上）进行5～10分钟后鉴别一个PNA片段上的寡核苷酸突变，所需的专用设备包括Idaho Technology公司的LightScanner（或HR-1）和罗氏的LightTyper，但某些实时PCR平台也有这种功能。

该方法还可用于检测新突变和未知突变，专用设备能够在短时间内分析384孔平板，使高通量分析成为可能。至少可以区分一个片段的4种熔解温度，用六种颜色标记探针。因此，至少一次能够探测24个靶标，因此这种方法很便宜，而且对引物设计没有要求，系统始终处于封闭的管中，降低了污染风险。一些变异在低分辨率平台中会丢失，但这种方法有望成为最流行的筛选和检测突变的方法。