拟南芥组织提取RNA及RT-PCR

互联网2013-08-19

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试剂和器皿

所有试剂都用DEPC水配置，所有器皿都在<chmetcnv>180℃</chmetcnv> 烘8hr或者在双氧水中泡半小时以上,`所有的离心管和PIPET都用新的。

DEPC 水。

RNA Extraction Buffer: <chmetcnv>0.2M</chmetcnv> Tris-Cl （Ph 8.0 ），<chmetcnv>0.4M </chmetcnv> LiCl ，<chmetcnv>25mM </chmetcnv> EDTA ， 1% SDS 。

<chmetcnv>3M </chmetcnv> NaAc pH5.2 。

<chmetcnv>2M </chmetcnv> LiCl 。

RNase free 的水饱和酚。

氯仿。

无水乙醇。

70% 乙醇。

DNase(RNase free) 。

冰若干。

研钵和研棒，<chmetcnv>180℃</chmetcnv> 烘8hr。

小棒磨，双氧水中泡半小时以上。

实验步骤

1．小量（如RT-PCR）：新鲜的绿叶或花等组织适量，置于 1.5 ml的离心管中, 盖紧管盖，立刻放入液氮中。取出后将1.5 ml离心管放入管内置满液氮的15ml离心管，保持低温环境。用小磨棒研磨成粉，加入400 m l RNA Extraction Buffer和400 m l酚，置于冰上。

大量(如NORTHERN)：收集大量的植物组织，用液氮速冻后在研钵中充分研碎，然后将植物组织粉末用新PIPET移入另一个预先加入适量的RNA Extraction Buffer和酚（体积比1：1）的研钵中，混匀后分装在1.5 ml的离心管中，每管800 m l。

2．剧烈震荡5次。

3．13200rpm 离心6 min,取上清(建议用酚抽两次)，移入另一个装有300 m l氯仿的1.5 ml离心管中，剧烈震荡。

4．13200rpm 离心6 min，取上清，移入另一个装有1000 m l无水乙醇和40 m l <chmetcnv>3M</chmetcnv> NaAc的1.5 ml离心管中，<chmetcnv>-20℃</chmetcnv> 放置20min以上。

5．13200rpm离心10 min,弃上清。

6．70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5min,弃上清,超净台吹干。

7．加入10-30 m l DEPC水。<chmetcnv>-20℃</chmetcnv> 短期保存,-<chmetcnv>70℃</chmetcnv> 长期存放。

（一般操作至此，如NORTHERN实验。高质量RNA的获取可以用以下步骤纯化，如RT-PCR实验。）

8. 加入400 m l <chmetcnv>2M</chmetcnv> LiCl, 尽量溶解。（LiCL可沉淀大分子量的RNA,如果要操作分子量较小的RNA样品，建议省去这一步）

9．13200rpm离心10 min,弃上清,加入100 m l DEPC水,10 m l <chmetcnv>3M</chmetcnv> NaAc,300 ul无水乙醇,混合均匀,-<chmetcnv>20℃</chmetcnv> 放置20min以上。

10．13200rpm离心10 min, 弃上清。

11．70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5 min,弃上清，超净台吹干。

12. 对 RNA 定量，取 RNA 用 DNase 处理， 1ugRNA 用 1 单位的 DNase 处理，处理体系不宜过大（ 10-20uL ）。 37 度放置 30min

13. 取部分处理的 RNA ，稀释至 RT 后准备用做模板扩增的浓度， PCR 验证是否有 DNA 污染

14. 将体积扩至300 m l（加入DEPC水），加入300 m l酚，剧烈震荡。

15. 13200rpm 离心6 min，取上清，移入另一个装有600 m l无水乙醇和30 m l <chmetcnv>3M</chmetcnv> NaAc的1.5 ml离心管中，<chmetcnv>-20℃</chmetcnv> 放置20min以上。

16．13200rpm离心10 min, 弃上清。

17．70%乙醇洗一次, 13200rpm离心5 min,弃上清，超净台吹干

18．溶于10-30 m l DEPC水。电泳定量,（OD定量）。<chmetcnv>-20℃</chmetcnv> 短期保存,-<chmetcnv>70℃</chmetcnv> 长期存放。

（13-18步也可省略，直接进行RT反应）

19. 取适量RNA进行RT反应（参见具体使用的试剂盒）

20. RT反应后，如果未作13-18部，需用酚/氯仿抽提，以去除12步加入的DNase.如做了13-18步，也建议用酚/氯仿抽提一下

21. PCR反应

(责任编辑：大汉昆仑王)