互联网2013-11-13
1. 渗透培养基:(1L)
1/2xMurashige-Skoog
5%蔗糖
0. 5克MES
用KOH调至pH5. 7
再加:10微升lmg/ml的6-BA母液
200微升Silwet L-77
Top agar
0. 1%琼脂PNS或水溶液
2. 筛选培养基平板
1xMS salt,或1XPNS
pH5.8
0. 8%琼脂
卡那霉素30mg/l (Columbia,LanDsberg),Nossen需50mg/l
3. 次氯酸钠溶液
活性氯5. 2%原液用无菌水临时稀释7%使用
1. 植物生长
1) 建议在直径7厘米的培养杯里种5处,每处种几棵,萌发一周后,每处只留下一棵最好的苗。
2) 将萌发的植物培养至茎高约3厘米时,去除其顶生花序。注意要避免伤及腋生花序。去除顶生花序将刺激腋生花序的生长。转化必须在去除顶生花序4天后进行。
3) 转化前,将已授粉花以及果荚去除掉。并使土壤吸足水。
4) 转化操作
5) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液l0ml,在转化前一天,转入人瓶培养过夜,第二天取出使用时农杆菌液0.D600当在1.2到1.6之间。室温5000rpm离心15分钟。弃上清,将农杆菌沉淀悬浮十相应体积的渗透培养基里,使0.D600在0. 8左右。
6) 用喷雾器将菌液均匀喷洒在待转化植株上,移入恒温室竖直培养。
7) 培养3到4周后,收种子。放在干燥环境存放2周。
2. 转化子的筛选
1) 筛选前一般都要消毒,先用70%乙醇浸泡2分钟,再用次氯酸钠溶液处理15分钟,在上述处理时要不停地悬浮种子,最后用无菌水洗四次。
2) 处理后的种子用Top aga均匀涂布在固体筛选培养基表面。一块150mm直径的平皿最多种1500棵。低温4度春化2到3天,移入恒温室培养。根据植物筛选抗性不同,来判断萌发的幼苗是否是转化子,一般卡那霉素筛选能够直观的通过黄绿苗来判断,而且一般萌发后2-3天即可判断出来,而潮霉素抗性的转化子不能通过黄绿苗来判断,需要在萌发后5-7天通过幼苗的发育来判断。
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