高效转化法

细胞
LiAc
YPAD 平板 YPAD 液体培养基

1. 取 10 μl 细胞在 YPAD 平板上涂布 2 cm²，培养过夜；或者接种 5 ml 的 YPAD 液体培养基，于 30℃ 震荡培养过夜。

2. 将一瓶 YPAD 培养基于 30℃ 平衡过夜。

3. 去 50 ml YPAD 培养基加到一个灭菌的 250 ml 的培养瓶中，接种一接种环来源于平板的细胞或 5 ml 液体培养基，混匀，测定 5 倍稀释后的光密度。

4. 于 30℃ 以 200 r/min 振荡培养，至 10 倍稀释后 OD₆₀₀ 为 0.2，相当于 2X10⁷ 个细胞/ml，需要 3.0~4.5 个小时。该培养物可用于 10 次转化。

5. 用一个灭菌的 50 ml 离心管收获培养物，3000 g 离心 5 分钟。

6. 倒掉培养基，用 20 ml 灭菌水重悬细胞，再次离心。

7. 倒掉水，用 1.0 ml 100 mmol/L 的 LiAc 重悬细胞，并转移到一个 1.5 ml 的微量离心管中。

8. 用微量离心机以最高转速离心 15 秒，用微量加样器吸出 LiAc。

9. 用 100 mmol/L 的 LiAc 重悬细胞，使终体积为 500 μl，于 30℃ 孵育 15 分钟。

10. 将 1.0 ml 的 ssDNA 样品煮沸 10 分钟，于冰水中迅速冷却。

11. 基本的转化混合物包括 240 μl 的 PEG、25 μl ssDNA、5.0 μl 质粒 DNA 和 45 μl 水。

12. 涡旋混匀细胞悬液，取 50 μl 加到标记的微量离心管中，离心用微量加样器除去 LiAc。

13. 向细胞沉淀中加入 350 μl 转化混合物，剧烈涡旋以重悬细胞。

14. 30℃ 水浴孵育 30 分钟。

15. 42℃ 水浴热休克 20 分钟。

16. 用微量离心机最高速度离心 15 秒，去掉转化混合物。

17. 每管加 1.0 ml 水，通过吹打和剧烈涡旋以重悬沉淀。

18. 取 10 μl 悬液稀释到 1.0 ml 灭菌水中，涂 100 μl 该稀释液到 2 到 3 块相应 SC 减样选择培养基平板上。

19. 将该 SC 减样选择培养基平板孵育 2~4 天，以获得转化子。