感受态细胞的制备[电转化法]

体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

实验目的：学习感受态细胞的制备过程

实验材料：大肠杆菌菌株DH5a或DH10B

实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA；

对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；

2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；

7．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；

3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5.4℃下3000g冷冻离心5分钟；

附注：

影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：

1)细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；

2)所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

3)经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

4)化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

5)所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

6)质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；

7)一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；