感受态细胞的制备

摘要: coli TG1单菌落,接种于5ml LB液体 培养基 中,37℃下振荡培养12小时左右,取50ul培养液转入5ml LB中,37℃振荡培养1~1．5小时至对数生长期OD600=0．5左右.2、 感受态细胞 的制备⑴、将培养液1．5ml转入离心管中,冰上放置20分钟.⑵、置于4℃,5000rpm离心5分钟,倒尽上清.⑶、添加一半菌液体积（750ul）预冷的50mM的CaC......

1、 受体菌的培养

从平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落,接种于5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,取50ul培养液转入5ml LB中,37℃振荡培养1~1．5小时至对数生长期OD600=0．5左右.

2、 感受态细胞的制备

⑴、将培养液1．5ml转入离心管中,冰上放置20分钟.

⑵、置于4℃,5000rpm离心5分钟,倒尽上清.

⑶、添加一半菌液体积（750ul）预冷的50mM的CaCl2,用枪轻轻吹打,使细胞悬浮, 冰上放置30分钟.

⑷、4℃,5000rpm离心5分钟,弃上清.

⑸、再加入200ul预冷的50mM的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置备用.

新鲜的感受态细胞在4~24小时之内可直接用于转化,也可加入总体积15%的无菌甘油, 混匀后置于-70℃可保存6个月,转化效率基本不变.

3、 转化

⑴、取200ul摇匀后的感受态细胞悬液,加入质粒4ul,用枪轻轻吹打均匀,冰浴30分钟.

⑵、42℃,保温90秒钟后,迅速放入冰中,冰浴5min.

⑶、加入37℃预热的1ml的LB液体培养基,混匀.37℃培养1小时,使细胞恢复正常生长状态.

⑷、3000rpm离心10分钟.

⑸、弃去1ml上清,余下的200ul用枪轻轻吹打均匀,使 细菌 充分悬浮后均匀涂布于含Amp的筛选平板上.

⑹、37℃正面向上放置半小时后,倒置培养8~12小时.

对照1、以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与转化组相同.

对照2、以同体积的50mM的CaCl2溶液代替感受态细胞悬液,其它操作与转化组相同.