电转化法（质粒DNA导入细菌细胞实验）

高压电转化简单，快捷可靠，而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。

菌落
LB 甘油 SOC
平板 离心瓶 聚丙烯管 电阻器 电转化池

1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液，37°C温和振摇培养5 h或过夜。

2. 将2.5 ml培养物加入到盛有500 ml LB培养液的2 L烧瓶中，37°C，振摇（300 r/min）培养至OD₆₀₀为0.5~0.6。

3. 细菌在冰水浴冷却10~15 min，然后转移到预冷的1 L离心瓶中。

4. 于2°C，5000 g离心20 min，弃上清，沉淀用5 ml预冷的水溶解。

5. 加入500 ml冰冷的水，混匀，按步骤3重复离心1次。

6. 立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。重复步骤5。

7. 立即将上清倒掉，用残余的液体重悬细胞。

8. （1）对于立即使用

将悬浮液加入到预冷的50 ml聚丙烯管中，2°C 5000 g离心10 min。置冰上，估计细胞沉淀的体积（约500 μl/500 ml培养液），沉淀用等体积的冰冷水重悬，并按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。

新鲜制备的细菌其转化效率要高于冻存的细菌。细胞密度大约2X10¹¹ 细胞/ml。

（2）冻存细菌

加入40 ml冰冷的10% （V/V）甘油，混合，然后按照步骤（1）离心， 估计沉淀的体积，然后加入等体积的冰冷的10%甘油，重悬菌体。按50~300 μl分装于预冷的微量离心管中。于干冰上冷冻并储存于-80 °C。

9. 为检测感受态的效果，按照以下各步骤将PBR322转化到感受态细菌。将合适体积的转化物（1、10和25 μl)涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养过夜。

计算转化率

每微克DNA=每滴液体体积（μl）含有的克隆数X10⁵。

新鲜生长的细胞，一般都有>10⁹ 克隆数/μgDNA。

有2.5X10¹⁰~14X10¹⁰ 转化子/μg。

10. 将电转化仪调到2.5 kV、25 μF，脉冲控制器调到200~400Ω。

11. 将1 μl质粒DNA （5 pg~0.5 ng）加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中，混匀。

增大DNA体积和高浓度的盐离子（应小于1 mmol/L）会降低转化效率。

12. 将转化混合物转移到已放置冰上5 min预冷的电转化池中，用Kimwpie吸水纸吸干 电转池的外表面，然后放人电转仪中，按操作进行脉冲电转化。

13. 取出电转化池，马上把细胞转移至一个含1 ml预热的SOC培养液的无菌培养管 中。于37°C，中速振荡培养30~60 min。

14. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上，选择和保存转化子。

1. 所有与细菌接触的材料都应该是无菌的。

1. 参考文献：Doweretal.，1988； Hanahan，1983。

2. 撰稿人：ChristineE. Seidman，Kevin Struhl，and Jen Sheen