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    基本方案1 用末端标记的引物 PCR 扩增 SSLP

    相关实验：基于 PCR 的基因分型实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    正向和反向引物 10 X T4 多聚核苷酸激酶缓冲液 ATP T4 多聚核苷酸激酶 模板DNA 10 X PCR 扩增缓冲液 4dNTP 混合液 Taq DNA 聚合酶 轻矿物油 2 X 甲酰胺载样液
    96孔微量板 热循环仪 用旧的X光胶片或者 Whatman 3MM 的过滤纸

    步骤

    1. 末端标记足够的可用以扩增100个样本的引物，吸取下列溶液至I.5m l 的微量离心 管 中 （ 附录3E ): IO jlJ 20jumol/L 的正向或者反向引物； 2. 5jul 10X T 4 多聚核苷酸激酶缓冲液； IOjul 10mCi/ml [7_32P ] A T P (3000C i/m m ol); ljul 50U/jul. T 4 多聚核苷酸激酶； 1.5jul H 2O 5 37°C孕 育 30m in。 如果一个引物含有重复序列（ 如 A l u ) , 则用另一个引物作标记以得到干净的 条带。 2. 65°C 加热反应液IOmin 使酶失活，如果需要，可以保存标记好的引物一2〇° C 至一周。 3•吸取5 4 模板D N A 至 96孔板的每个孔中，以备接下来的热循环用。用盖子或透^ 外光的塑料膜盖上板子，放于冰上防止挥发。 4.根据要扩增的DNA模板量，混合以下的溶液，以准备适量的PCR混 合 物 （ 每 1〇〇 个模板，多加1 0 % 的量以补充在吸取液体过程中的损耗） ： 220^110 X 扩 增 缓 冲 液 ； 352j
    44jul 20|^mol/L 正向引物； 55jul 20jum ol/L反向引物 27. 5 4 标记反应液（ 来自第2 步） ； I lp l 5U/V1 Tag DNA 聚合酶； 940. H 2O 。 5. 9 6 孔板的每个孔中加15jul的 P C R 混合液，热循环前将P C R 板放冰上或放冷藏块 中，以减少引物错误退火的机会。 6•用6〇 4 的轻矿物油覆盖每个孔以减少挥发，在 B eckm an或 S o rv a ll的平板离心机上 4°C， 1000〜 2000r/m in 离心 96 孔板。 7.根据选择的引物和热循环仪的设备设置循环参数；引物的T m 值 是 60°C 的标准的 P C R 反应条诛见表2.1 .1 。 通 常 ，退 火 温 度 先 设 成 低 于 最 低 的 P C R 引 物 T m 值 5°〇， 然 后 如 果 有 非 特 异 条 带 出 现 则 逐 步 的 向 上 调 整 退 火 温 度 。 表 2 . 1 . 1 扩增S S L P的热循环参数 . 过 程 温 度 Perkin-Elmer 9600 循 环 仪 Generic热 循 环 仪 起 始 变 性 94〇C 3 min 3 min 3 0 个 循 环 94°C 15s 30s 55〇C 30s 2 min 72°C 30s 2min 最 终 延 伸 72°C 5 min 7 min 保 持 4°C — — 8 . 不加孔板开始热循环，当温度达94°C时，放孔板到热循环仪上完成热循环。当循环 完成时，每个孔加20^1的 2X 甲酰胺载样液。如果需要，可在加载样缓冲液之前或 之后，将孔板放置于耐热有机玻璃盒子里保存在一20°C 不超过2 周 （ 最好立即用） 。 9 . 准备6 % 的变性聚丙烯酰胺胶（ 附录3 F ) 。 4 0 W 预电泳Ih (恒定功率） 。在跑胶的过 程中可以调节功率使胶的温度保持在约55°C。 1 0 . 上样前， 94°C 5 m in变性样品后很快放冰上冷却。通过吹打缓冲液将胶孔里的尿素 清除。每个胶孔加2 4 的样本，每个胶孔的样本里都包含有一个标记了的D N A 分 子质量标记（ 如 Y-32P 标 记 的 I 酶消化的pB R 322) 。 为了比较在不同的胶上跑 着的大批P C R 产物，每个胶都要跑一个或者两个参考D N A 的 P C R 产物或者一个 I b p 分辨率的7_32P 标记的M 1 3序列内标。 11. 在恒定的功率下跑胶2〜3h ，保持胶的温度在55°C ，直到二甲苯青跑到胶底。 12. 将胶板的夹子取掉，放平，硅烷化面向上。用一个长的金属 压 刀 慢慢分开胶板（ 胶 应该黏附于底板上） ，将一个用旧的X 光收片或者'Whatman 3 M M 的过滤纸放在胶 上，将于胶之间的气泡赶出。将胶板提起来慢慢的将胶从玻璃板上剥落，用透紫外 光的塑料膜将胶包裹起来。用一个增光屏在2〜 2〗 h —70。(：放射自显影照相。

    来源：丁香实验

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