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    基本方案3 无放射性的多重分析SSLP

    相关实验：基于 PCR 的基因分型实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    模板DNA
    10XPCR扩增缓冲液 混合引物 Taq DNA 聚合酶 轻矿物油 Qiaex Gel Extraction Kit (Qiagen） 2X 甲酰胺载样缓冲液 M13序列泳道内标 TBE 缓冲液 预杂交液 地高辛标记的探针 Oligo 清洗缓冲液 阻滞液 碱性磷酸盐连接的抗地高辛Fab片段 检测缓冲液 底物缓冲液 CSPD
    96孔板 0.2ml 薄壁 PCR 管 Blotting 滤纸 测序胶转移装置 杂交烤箱 摇床 透明的塑料胶片 自动放射自显影胶片

    步骤

    1. 24 重 分 析 的 设 置 （8 个 D N A 模 板 加 2 4 对引物） ，将 0.2m l 的细长的P C R 管按图 2^1. 2 所示排列成96孔格式，放冰上。分别吸第一个家系成员的模板DNA5jul到八 行 的 24个管子中，吸第二个家系成员的D N A 入 B 行 ，直到所有8 行都力口满。 2. 加前第12对引物混合物各15W 到放置于冰上的96孔板中。 混合模板和引物以12 个为一组因为大多热循环仪一次只能操作一块板子，而第 3 步的主要的混合物需要在循环扩增前准备。 3. 在置于冰上的I.5m l 的离心管中混合下面的溶液（ 最终是49〇4): M O iUl I O X P C R 扩增缓冲液； 112|ul 2. 5m m o l / L 4d N T P 混合液； 231jul H 2O ; 7pl 5U/jLtl T a g D N A 聚合酶。 4. 每个孔加35^1的第3 步的混合液到第2 步的孔板中，从开始的引物混合液中吸取5jLj 到 96孔中第1 列 的 8 个管子中，重复加引物从第2 列到第12列 ，直 到 12对引物的 每对引物都和8 个 D N A 模板的每一个混合。 5. 用 M i croA m p Full Plate盖子盖上管子，迅速放到热循环仪上预热至94°C 。如果热循 环仪没有加热盖子，则每个孔加30y 轻矿物油。按下面的流程执行P C R 反 应 （ 基本 方 案 1)。 第一步： 5 min 94°C (变性) 3 0 个循环： IOs 94°C (变性) 30s 55°C (退火) 30s 72°C (延伸) 最后延伸： 5min 72°C (延伸) 最后一步： 无限时间 4°C (保持) 这些参数对于T m 值 为 60°C 的引物是理想的，虽然对了m 值 为 55〜7C T C的引物 都曾成功地扩增。如 果 P C R 失败，根据引物的T ra值优化退火温度。 6. 重复第2〜5 步 ，扩增加有剩下的12对引物混合液的13〜24列 的 D N A 。 7. 从水平行的24 个管子中每个取IofjJ 混合到一个管子中，这 2 4 个管子都是来自于同 —人 的 D N A P C R 反 应 产 物 （ 共 240M )。
    8. 加 3 倍 体 积 的 Q X iI 溶 液 （720W ) 和 IOjLd玻璃珠悬浮液，旋涡振荡，室温孕育 5m i n ，最大速度离心约30s，吸取并倒掉上清。加 〇.5m l Q X 3 溶液，旋满振荡，最 大速度离心约30s ; ' 吸取并倒掉上清。再用最大速度离心吸掉所有残留的上清。加 20W 水重悬珠子， 42°C 孕育5m i n 使 D N A 从玻璃珠中洗提出来。如果必需，保存洗 提的 D N A 于一20°C 。 9 . 准 备 5 % 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 （ 附 录 3F )，用 0.4m m spacer。 70W 恒压预电泳 20〜30m i n o 10. 最大速度离心混合的D N A 样 本 I m i n (混合有玻璃珠的） ，然后混合一下溶液： 0 •5〜2. O iUl混合的D N A 样本； 1 倍体积的2 X 甲酰胺载样缓冲液； 0. 2|ul M l 3 标准大小的内标。 11. 上样前，短暂的94°C 热变性D N A 样 本 2〜3m i n ，然后快速地置于冰上。用 T B E 冲 洗胶孔以去除尿素，每道上1〜3^1样本，于 70W 在 T B E 缓冲液中跑胶1.5〜2h 。 为了能识别参考等位基因片段是I O O b p 的 S S L P ，跑胶到二甲苯青F F 距胶底大于 等 于 15c m 时停止。对于大于200b p 的 S S L P ，跑胶到二甲苯青F F 距胶底大于等于 5. 5c m 时停止。 12. 将胶板从电泳的仪器上卸下，平放胶板，将上面的胶板移去。用 TB E 缓冲液浸湿 一 张 b b t 滤纸，将多余的缓冲液滴干，滤纸的光滑面朝胶放下，避免有气泡。通过 提起滤纸缓慢的将胶从玻璃板上剥离下来。如果胶没有黏附到湿滤纸上，则用一张 干纸将blot纸上多余的缓冲液洗掉。将滤纸和胶放置于TE 90 GeneSweep测序胶 转移装置上，胶面向上。戴手套，用 T B E 缓冲液浸湿一张Hybond-N膜 ，小心地 将膜放在胶表面，避免有气泡。用 T B E 缓冲液浸湿另一张blot滤纸，放置于膜的 上面，这样就成了滤纸、胶、膜、滤纸的夹层结构。 I3•根据G e n e S w e e p 仪 器 electroblotting的操作手册指示，转 移 完 全 后 （ 大 约 5m i n )， 将最上层的滤纸去掉，将膜从胶上剥离，用戴手套的手将膜上残留的胶完全去掉。 8〇°C 烘烤膜20m i n ，用紫外交联， D N A 面朝上， 120m J /c m 2, Stratalinker设为自动 交联。 也可以用Capillary action的 S o u t h e r n 印迹方法转膜（ 附录3G )。 14. 将膜卷起成管状，放入一个38m m X 300m m 的玻璃管中，加 25m l 预 杂 交 液 （ 可杂 交 800c m 2 的点，根据特异的点大小调整） ，在杂交炉里37°c 孵 育 I5m in ，然后将杂 交液倒掉。 15. 力卩 I O p m o l 地 高 辛 标 记 的 探 针 到 I O m l 的预杂交液中，混 合 （ 终浓度应该是约 l p m o l/100c m 2 膜） 。加溶液到有斑的管子中，在杂交炉中37。 〇孵育大于止。 用由M 1 3 的抗统一引物做成的探针用于第一次杂交以全面评估胶和转移的 质量。 对于过夜的杂交，大量的探针可以减少2 倍 ，如果两个S S L P 标记可以区分大 于 50b p (即它们的带不会重叠） ，那么这两个S S L P 可以通过混合探针被同时检测 (每个 l p m o l/l O O c m 2 膜） 。 16. 室温用100m l 的 oligo水缓冲液洗6 次，倒掉水前用力的摇管子几次。 立即加 5〇ml
    新鲜的预阻滞液，室温在摇床上摇30min，弃去溶液。 17. 用 50ml检测缓冲液混合5 4 的碱性磷酸盐连接的抗地高辛Fab片 段 （I : 10 OOO稀 释)。 加入到杂交斑的管子中室温在摇床上摇30min， 弃去抗体溶液。 18. 快速地用50m l 的检测液漂洗杂交斑。室温下用80m l 的检测液洗3 次每次都在摇床 上摇5min。 19. 快速地用25m l 的底物缓冲液漂洗杂交斑，弃去缓冲液。加 10ml 〇.2mmol/L 的 C S P D 37°C摇 lOmin。 20. 从管子里拿出杂交斑，让其潮湿但不滴水，用透明的塑料胶片包裹或将其置于两层 薄的聚丙烯薄片中。用玻璃吸管将气泡吸去。加了 CSPD 6〜8h 内放平包裹的膜， D N A 面朝上，在胶片盒中， 37°C 暴露放射自显影30min。 21. 为了剥掉斑点，转移到38m m X 300m m 的硅玻璃管中，力卩 IOOml的 2mmol/L E D - T A /0.2% S D S (预热至7〇° C )， 70°C 在摇床上孵育lOmin，弃掉溶液再重复。保存 于一定湿度，室温下，封 闭 38m m X 300m m 的管子，用 Sanran包裹，直到下次被 标志探针。用其他的地高辛标记的探重复第14〜21步。

    支持方案1 制备 MI3 序列内标

    M 1 3 序列ladder的 A 道在基本方案2 中作为跑胶中每个胶孔的内标使用，以区分 SSLP-P C R 的产物。 M 13D N A 、 D T T 、测序反应缓冲液、 T 7 D N A 聚合酶和终止缓冲液都包括在D N A 测序手册2. O 版 本 中 （ U . S. Biochemical)。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 在 T E 缓冲液中的 M 1 3 m p l 8 单链 D N A (U . S. Kochemical) 0. Spmol/pIMIS 统一测序引物（5^G T A A A A C G A C G G C C A G T -3'; 如 U . S. Biochemical) V 5X 测序反应缓冲液（ U . S. Biochemical) V T E 缓冲液 V 〇.lmol/L D D T • 77. 5|umol/L 4dNTP 混合液 13U ； V 测序 T 7 D N A 聚合酶 2. 0 版 （ U . S. Biochemical) 终止反应混合液： d G T P 、 d A T P 、 dCTP、 dTTP 每种 80pmol/L ，力口gpmol/L ddATP 在 50mmol/L 的 NaCl 中 （ U .S. Biochemical 有准备好的混合物） ■ V 2X 甲酰胺载样缓冲液 1.在微量离心管中混合下面的成分： 38jug M 13mpl8D N A ； 24pl 〇.5pmol/jul M 13 统一测序引物; 4(^15父测序反应缓冲液； 加 T E 缓冲液至2004。 65°C加热2min退火，然后缓慢冷却至小于35°C 。最大速度短暂离心
    2. 加以下成分到冷却的退火混合液中： 20jA 0.lmol/L D T T ； 8M17. 5jumol/L 4dNTP 混合液； 32^1 H 2O 5 , 454 T E 缓冲液； 5“测序T 7 D N A 聚合酶。 室温下放置7m i n 。 3. 预热一个1.5c m 的微量离心管，管中有200^1的终止混合液，加人第2 步的混合液， 37° C 孵育5min。加人32 0 ^ 的 2X 甲酰胺载样缓冲液终止反应。可无限期地保存于 —20〇 C 。

    支持方案2 用末端转移酶的地高辛标志的探针

    在基本操作流程2 中用于扩增每个S S L P 的 M 13抗统一引物和正向或反向引物都 是用地高辛-11-d U T P 标记尾部的。为了只检测P C R 产物的一条链，对于一个S S L P 只 用一个引物作为杂交的探针是很重要的；如果C A 链和G T 链都需要同时检测，它们的 不同迁移模式将会使分型变得复杂。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) V 5 X 终止转移酶反应缓冲液， p H 6.6 25m m o l / L CoCl2 6. 6ium〇 l/L 正向或反向引物用于扩增每个SSLP (基本方案2) 6.6pmol/L M 13 抗统一引物 W - A C T G G C C G T C G T T T T A C D l m m o l / L 地局辛-11- d U T P ( Boehringer M a n n h e i m ) 10mmol/L dATP 50U/； xl终止转移酶（ Boehringer M a n n h e i m ) V 〇 • 2mol/L E D T A , p H 8. O 1. 为每一个引物（ 包括M 13抗统一引物）准备反应混合液： 6jul 5 X 终止转移酶反应缓冲液； 6jul 25mmol/L CoCl2； 15^1 6. SiLtmol/L 引物； l|ul lmmol/L 地高辛-11-d U T P ; 1M 1 lOmmol/L d A T P ； I1Ul 50U / 4 终止转移酶。 2. 37°C 孵育20min，然后加入Z W O J m o l /L E D T A 终止反应，标志好的引物可以无限 期地保存于一20°C 。 在这个方法里，标志时末端的长度平均是 50bp (10〜 lOObp)， 5 个地高辛-11- d U T P 的核苷酸位于末端，可以用点印迹的方法检测标志反应。 参考文献： D i b d a Z . ， 1996; Weber and M a y ， 1989; Weissenbach 衫aZ. ， 1992 编者 ： Thomas J. Hudson, Chris D . Clark， Michele Gschwend， and Erica Justice^Higgins

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    来源：丁香实验

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