CDP 用于体外转染

CDP 用于体外转染

材料

试剂

完 全 培 养 基（含 抗 生 素 和 血 清），针 对 细 胞 类 型 进 行 合 理 选 择含 有 环 糊 精 的 聚 阳 离 子（C D P ; 20m g /m l )

冻干后的固体溶于不含 DNase 和 RNase 的水中。储液为无色。

核 酸（80umol/L)

D N A z y m e (Eurogentec)

质 粒 D N A (p D N A )

小 干 扰 R N A (s i R N A ) (D h a r m a c o n ， Integrated D N A Technologies)

用细菌 DH5 〇 t (Invitrogen) 扩增 pDNA, 纯化使用 Novagen’s UltraMobius 1000 试剂盒。

DNAzyme 和 siRNA 为化学合成，经 高 效 液 相 色 谱（HPLC) 纯化，并用凝胶电泳验证。

核酸用不含 DNase 和 RNase 的水，或者不含 RNase 的乙酸钾缓冲液溶解。

O p t i - M E M I 低 血 清 培 养 基（Invitrogen)

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S ，灭 菌）

胰 酶

仪器

细 胞 培 养 板（6 孔 或 2 4 孔）

细 胞 培 养 箱（37°C , 5 % C O 2)

方 法

1.转染前一天，胰酶消化并收获指数增长期的贴壁细胞。将细胞接种到6 孔 或 24孔板中，细胞密度24孔板中为每孔5X 10⁴ 个细胞， 6 孔板中为每孔2. 5X 10⁵个细胞。

2•每孔加入I m l (24孔板）或 5m l ( 6 孔板）的完全培养基，在细胞培养箱中37°C ，5 % C O 2 下培养24 h 。

3.配制复合物溶液：将 1 倍体积的C D P 储 存 液（典型的 IOm I每孔）加人到等体积的核酸储存液中。

对于体外转染，核酸浓度如高于0.2 mg/ml，会导致核酸不能被等体积的CDP溶液完全结合 。这种情况下混合液通常为不透明或乳状，而且基因表达或基因敲除效果差。

4.在每体积复合物溶液中加入9 体 积 的 O p t i - M E M (24孔板中每孔加人180ul OptiM E M )。

5.从孔中吸出完全生长培养基。用 0.5m l P B S 洗涤细胞。

6•每孔加人200ul(24 孔板）或 1000ul (6孔板）的复合物/Opti-M E M 的混合液。将培养板放回培养箱中培养4 h 。

7.从孔中吸除复合物/Opti-M E M 的混合液。加 人 I m l (24孔板）或 5m l (6孔板）的完全培养基。

8.在适当的时间，进行基因表达或基因敲除的检测。

用 C D P 进行体内转染

材料

试剂

金 刚 焼 -PEI (50m g/m l)

A I > P E G ，乳 糖 封 端（A I > P E O L a c )

AI> P E G , 不 含 配 体（A I > P E G )

AI> P E G ，偶 联 转 铁 蛋 白（A E H P E O T f )

冻干后的固体溶于不含 D N a s e 和 R N a s e 的水中。储 液 为 无 色（A E H P E G 和 A I > P E O L a c )或红色/橙 红（A D ^ P E O T f )

含 有 环 糊 精 的 聚 阳 离 子（CDP， 20m g/m l)

冻干后的固体溶于不含 D N a s e 和 R N a s e 的水中。储液为无色。

D-葡 萄 糖（1 0% m /V ，溶于水中 [D 10 W )

将葡萄糖溶于不含DNase 和 RNase 的水中， 0.2um 的微孔滤膜过滤。所有体内实验中，注射液葡萄糖溶液终浓度均为 5% 。

小 鼠（20 g )

核 酸（80umol/L )

D N A z y m e (Eurogentec)

质 粒 D N A (p D N A )

小 干 扰 R N A (s i R N A ) (D h a r m a c o n , IntegratedDNATechnologies)

用细菌 DH5<x (Invitrogen) 扩增 pDNA, 纯化使用 Novagen’s UltraMobius 1000 试剂盒。

DNAzyme 和 siRNA 为化学合成，经 高 效 液 相 色 谱（HPLC) 纯化，并用凝胶电泳验证。

核酸用不含DNase 和 RNase 的水，或者不含 RNase 的乙酸钾缓冲液溶解。

仪器

27 号针头

I m l 注射器

方 法

1•将 CDP、 AEKPEG 和 AD——P E O 配体在水中混合，最 终 AD : (3-C D 的摩尔比为 I : 1。

2 . 将上述溶液（约 5CVg/20 g 小鼠）加人到等体积的核酸溶液中。

3 . 加入一体积（约 lOOpg^Og 小鼠）无菌 DwW 到等体积的上述复合物溶液中。

4 . 用带有 27 号针头的Im I 注射器吸取上述复合物溶液。

5.将小鼠的尾静脉预热。

6•在 2〜3s 内将复合物溶液注射到尾静脉中。