TALEN 多等级连接法

TALE 蛋白的特异 DNA 序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，针对任意序列的靶 DNA，科学家们可以设计组装任意的 TALE 单元结合目标 DNA 双螺旋序列。TALEN 靶点设计好后，需要组装 RVD 单元，构建 TALEN 质粒。

TALEN 多等级连接法的原理是利用 Golden Gate 切-连反应生产环状化的六连子，再将成熟的 3 段六连子拼接并且构建到 TALEN 骨架当中，最后得到 TALEN 的表达质粒。所谓 Golden Gate 切-连反应，指的是通过使用 II 型限制性内切酶和高特异性的黏性末端连接酶在多次循环的步骤中消化掉错误的连接产物并且重新连接未连接的片段。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

试剂：

①DNA 聚合酶

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

③培养基

④DNA 连接酶

TALEN 多等级连接法的主要操作步骤如下：

1．利用 PCR 方法克隆出每一种碱基对应的重复单元的单体，并建立模板库。

2．通过凝胶电泳纯化这些单体，并且将浓度标准化。

3．通过第一步 Golden Gate 切-连反应产生环状化的六连子。

4．利用质粒保护型外切酶将未连接成环的 DNA 分子去除。

5．通过 PCR 方法得到线性的六连子产物，并且将其扩增。

6．通过凝胶电泳纯化这些线性六连子，并且将浓度标准化。

7．通过第二步 Golden Gate 切-连反应将 3 段线性六连子拼接并且连接到 TALEN 骨架载体当中，获得成熟的 TALEN 表达质粒。

8．将以上产物纯化后转化，并进行菌落 PCR 检测。