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磁珠载体 TALEN 组装构建法

相关实验:TALEN 的组装构建

最新修订时间:

简介

TALE 蛋白的特异 DNA 序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景,针对任意序列的靶 DNA,科学家们可以设计组装任意的 TALE 单元结合目标 DNA 双螺旋序列。TALEN 靶点设计好后,需要组装 RVD 单元,构建 TALEN 质粒。

原理

磁珠载体 TALEN 组装构建法的原理是将 DNA 分子固定化到固相载体磁珠上面,利用固载体便于清洗底物、纯化产物的特性,进行连续的消化、连接等操作,逐步地将 RVD 单元串联一起。该方法实现了快速、高效大规模制备 TALE。

材料与仪器

器材:


①凝胶电泳仪


②水浴锅


③低温离心机


④培养箱


⑤PCR 仪


⑥电转仪


试剂:


①D 链酶亲和素(streptavidin)覆盖的磁珠


②卡那霉素;氯霉素;潮霉素


③培养基


④限制性内切酶、DNA 连接酶


⑤琼脂糖凝胶

步骤

磁珠载体 TALEN 组装构建法的主要操作步骤如下:


1.设计一段生物素(biotin)修饰的 DNA 双链 linker 序列(长度≥60bp),将其固定化到链酶亲和素(streptavidin)覆盖的磁珠上。


2.用限制性内切酶 3'处理固定化的 linker 序列并产生 3'黏性末端。


3.同时用限制性内切酶 5'处理 TALE 连接单元(连接单元可以是 1 个 RVD 单元,也可以是 4 个 RVD 单元),产生的 5'黏性末端,并与上一步骤中的 3'黏性末端可以互补配对结合。


4.使用 DNA 连接酶将上述两步产物连接,并洗脱未连接底物。


5.重复步骤 2,用限制性内切酶 3'处理上一步骤所得产物,重新生成了一个 3'黏性末端。再与经限制性内切酶 5'处理过的新的 TALE 连接单元结合,在 DNA 连接酶的作用下连接,并洗脱未连接产物。


6.经过 4~16 次循环,拼接 TALE 连接单元,最终可以得到固定化的 16 或者 20 个重复的连接子。


7.用限制性内切酶将连接好的 DNA 双链分子从固相界面上剪切下来,通过凝胶电泳纯化。


8.将纯化后的 DNA 双链分子连接到 TALEN 骨架载体当中,获得完整的 TALEN 表达质粒。


9.将以上质粒转化后通过菌落 PCR 检测和测序鉴定,最终可以得到正确的 TALEN 表达质粒。

来源:丁香实验

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