TALEN 单元组装法构建法

TALE 蛋白的特异 DNA 序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，针对任意序列的靶 DNA，科学家们可以设计组装任意的 TALE 单元结合目标 DNA 双螺旋序列。TALEN 靶点设计好后，需要组装 RVD 单元，构建 TALEN 质粒。

TALEN 单元组装法构建法的构建原理是首先构建出识别 4 种碱基的 4 种单体质粒，然后利用同尾酶（isocandamer restriction enzyme）的特性循环往复地酶切-连接，进行质粒的构建，最终组装成识别目的靶 DNA 的 TALE 质粒。

器材：

①凝胶电泳仪

②水浴锅

③低温离心机

④培养箱

⑤PCR 仪

⑥电转仪

试剂：

①限制性内切酶

②卡那霉素；氯霉素；潮霉素

③培养基

④DNA 连接酶

TALEN 单元组装法构建法的主要操作步骤如下：

1．Single unit 载体为单元组装法的基础载体。通过 PCR 的方法构建分别识别 A，T，C，G 的重复单元单体质粒。其中重复序列结构上游是 SpeI 酶切位点，而其下游则是 NheI 和 Hind III 酶切位点（图 5-2-14a）。

2．将第一个单体 T 质粒用 Nhe I＋Hind III 双切，得到去环状化的 DNA 片段；第二个单体 A 质粒用 Spe I＋Hind III 双切，得到的 DNA 片段仅包含重复序列。通过凝胶电泳纯化上述产生的两段 DNA 片段。由于 SpeI 和 NheI 是同尾酶，所以这两段 DNA 片段可以通过连接反应连接，形成一个二连子 TA 质粒。将上述重组质粒转化至受体菌后挑菌，菌液 PCR 鉴定，延伸时间 30 秒～2 分钟（取决于 unit 的数目确定延伸时间。PCR 鉴定引物序列为：M13-47：5＇-cgccagggttttcccagtcacgac-3＇；RV-M：5＇-agcggataacaatttcacacagga-3＇）。 通过 PCR 产物大小挑选阳性克隆。每个 unit 长度约为 102bp，同时加上载体骨架片段 156bp。例如，2 个 unit PCR 产物大小约为：102x2＋156＝360bp；4 个 unit PCR 产物大小约为：102x4＋156＝564bp，等。如同上述步骤，得到其他类型的二连子质粒。

3．同样的双酶切-连接操作，将二连子拼接成四连子，四连子拼接成八连子，最后构建一定长度的 TALE 重复单元质粒。

4．构建 TALEN 将上述质粒当中重复序列部分用 SpeI 和 NheI 酶切出来，连接到用 NheI 酶切的 TALEN 架载体当中，获得成熟的 TALEN 表达质粒。

（1）Nhe I 单酶切 pCS2-TALE-pedas 和 pCS2-TALE-perr（5.5 kb），去磷酸化，回收。

（2）SpeI 和 NheI 双酶切组装好的 TALE，切胶回收；与上述去磷酸化的 pCS2 骨架连接，转化，Amp 抗性涂板。对抗性克隆进行菌批鉴定并 sp6 通用引物测序确认插入的方向。

（3）PCR 鉴定 TALE 片段连入方向测序引物：