质粒双酶切怎么做阴性对照？

质粒双酶切的阴性对照可以按照以下步骤进行：

准备质粒DNA样品。从细菌中提取质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和大小。

进行一次双酶切反应，但其中一种限制性内切酶的酶切位点在另一种酶切位点的上游。

将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否存在目的条带。如果存在目的条带，说明双酶切成功；如果不存在目的条带，则说明双酶切失败。

如果没有出现目的条带，可以尝试增加酶的用量、延长酶切时间或提高酶切温度等措施，以优化双酶切反应条件。

需要注意的是，在进行双酶切反应时，需要确保两种限制性内切酶的酶切位点在质粒DNA上相邻或相距不远，以便于后续的连接反应。同时，在进行阴性对照时，需要确保另一种限制性内切酶的酶切位点在质粒DNA上与目的条带的位置相符，以排除其他因素对实验结果的影响。

可以用单克隆做对照，没有对照无法确定酶切的位置

酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.

做转化时,也要进行对照. 设4个:

A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.

B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.

D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.