过表达细胞株的构建

过表达细胞株的构建指的是通过生物、化学、物理等细胞转染手段将某个特定基因的表达水平保持稳定的提高，从而实现在该细胞系中特定基因或蛋白功能增强。基因过表达作为一种传统的分子生物学技术，被认为是研究基因功能的实验策略之一，至今依然在生物学研究中发挥着重要作用。

过表达稳定细胞系（Overexpression Stable Cell Lines）的构建利用慢病毒转染、电转等技术手段将特定的基因序列整合到宿主细胞的染色体上，使得目的基因能够在宿主细胞内长期且稳定的表达。

基因功能研究 、免疫/杀伤/增殖等 、抗体药物的活性筛选（细胞水平的结合和阻断）、CAR 分子的杀伤活性评价。

（以慢病毒 pMSCV 载体为例）包含目的基因和 eGFP-Tag 的 pMSCV 质粒、带有 eGFP-Tag 的 pMSCV 空载质粒、GAG 质粒、VSV 质粒、Puromycin、Polybrene 、Lipo3000、HEK293T 细胞、opti-MEM、DMEM、FBS、双抗、0.45 μm 的滤膜、荧光显微镜等。

1、基因的构建

1) 根据目的基因 mRNA 编码区设计引物，分别在引物两端加入酶切位点 EcoRI 和 Bgl II。

2) 从细胞中提取目的基因 mRNA，然后逆转录成 cDNA，然后从 cDNA 里面用引物把目的基因的 CDS 区扩增出来。PCR 扩增出带有酶切位点的目的基因编码区序列，连接至 pMD19-T 载体后转化至感受态细菌 DH5α，分别进行菌落 PCR 鉴定和酶切鉴定。

3) 使用 EcoRI 和 Bgl II 双酶切下目的基因序列，电泳割胶回收纯化，连接到 pMSCV-eGFP 载体。再次转化到感受态细菌 DH5α，菌落 PCR 鉴定和酶切鉴定成功后，送至公司测序、鉴定。

4) 鉴定成功后，将质粒转化至感受态细菌 DH5α 中，并进行无内毒素质粒抽提。GAG 质粒和 VSV 质粒同样可以转化至感受态细菌 DH5α 中，并进行无内毒素质粒抽提。质粒抽提后冷冻于 -20 ℃ 保存。

2、慢病毒包装

1) 使用 DMEM 完全培养基培养 6 cm 皿 HEK293T 至汇合度为 70~80%。采用 opti-MEM 和 Lipo3000 分别转染含有目的基因的 pMSCV-eGFP、VSV、GAG 质粒及对照载体，每皿加入脂质体-质粒转染混悬液按购买脂质体相关说明书操作定量。继续培养 24 h。

2) 24 小时后，将培养基更换为新鲜的 DMEM 完全培养基，放进细胞培养箱继续培养 48~72 h。

3) 48~72 h 后收集上层培养液，并过 0.45 μm 滤膜，采用 ELISA 法对所获得的慢病毒载体进行病毒滴度测定。如不及时使用可以冻存于 -80 ℃。

3、慢病毒转染

1) 转染前 1 天将细胞接种 6 孔培养板，感染时细胞的融合率约为 50%，感染前需换液，加入 1 mL DMEM 完全培养基。

2) 病毒冰浴融化后加入相应体积的病毒液及聚凝胺（Polybrene），混匀后放入 37 ℃ 孵箱中继续培养

3) 4 h 后补充 1 mL 培养基，14 h 后换液（24 h 内换液即可）。

4) 病毒感染 72 h 后用倒置显微镜观察荧光，监测感染效率，出现较多荧光时将等量的转染细胞和未转染细胞分别加入等浓度 Puromycin（Puromycin 或其他抗生素筛选浓度需要事先摸索）。

5) 待未转染细胞全部死亡并且可观察到满意荧光量时，降低 Puromycin 浓度培养。也可以挑去单克隆细胞株进行进一步培养，以得到满意的稳定表达目的基因的细胞株。

6) 使用 qRT-PCR 和 Western blot 的方法检测目的基因的表达量和蛋白水平是否显著提高。

7) 由此可得三组细胞株：a. 正常细胞株；b. 空载病毒载体感染的细胞株；c. 过表达目的基因的病毒载体感染的细胞。

8) 在后续培养传代该稳转细胞株时，培养基中需添加低浓度 Puromycin 做压力筛选条件。

1. 为避免慢病毒感染后细胞死亡，务必保证原始细胞无支原体污染。

2. 查阅压力筛选条件在目标细胞系中稳转株筛选的致死用量信息。

3. 查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的最佳滴度。

4. 转染后可以进一步进行单克隆稳转株培养，可采用稀释法和培养皿挑取法。

5. 慢病毒转染载体种类繁多，应选择适合目的细胞系的载体进行病毒的包装和转染。

转染时病毒滴度较低

可以将 6 cm 皿培养的 HEK293T 更换为 10 cm 皿培养，或使用超速离心沉淀法或 PEG-8000 浓缩法提高病毒滴度。