🔥 过表达载体的构建

过表达载体是将目的基因 CDS 编码区构建到相应的质粒或者病毒载体中，从而在宿主细胞中高效表达大量目的蛋白的质粒载体。过表达载体有多种构建方法，这里介绍一种常见方法——同源重组法。

使用两端带限制性内切酶位点的 PCR 引物扩增目标 DNA 片段，同时用对应限制性内切酶切割质粒载体，再使用同源重组酶连接载体与扩增后的 DNA 片段。

基因功能研究、大量目的蛋白制备。

目的 DNA 片段、引物、高保真酶

限制性核酸内切酶、过表达载体

胶回收试剂盒、同源重组酶、感受态细胞

LB 培养基、质粒提取试剂盒、移液枪

PCR 仪器等

1、双酶切质粒载体：

在过表达载体上选择两个限制性酶切位点，使用对应的限制性内切酶双酶切质粒载体；例如酶切反应均使用 Fermantas 公司生产的 EcoRI 内切酶（快切酶）和 XbaI 内切酶（快切酶），buffer 采用的是 FD Green Buffer（绿色）。

PCR 回收产物的酶切采用 20 ul 体系，具体反应如下：

PCR 回收产物             16 ul
XbaI                           1 ul
EcoRI                         1 ul
FD Green Buffer        2 ul

37 ℃ 烘箱反应 30 min。

2、琼脂糖凝胶电泳法回收切割后的线性载体，胶回收方法请参照试剂盒说明书严格操作。

3、目的 DNA 片段两端加上限制性内切酶位点：

根据目的 DNA 序列以及选定的两个限制性内切酶位点设计引物，以目的 DNA 片段为模板，使用设计好的引物及高保真酶进行 PCR 扩增反应。对 PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳法回收。引物设计方法见下图，引物设计网址（http://123.56.75.195/）。

4、目的 DNA 片段连接到载体的两个酶切位点之间：

将上述线性化载体与 PCR 扩增后的目的片段按照一定比例混合，在一定的温度以及同源重组酶的催化下，即可将目的片段插入至载体中（具体混合比例，以及反应温度和时间可参考所使用的同源重组酶使用说明书）。

以下例子可做参考（ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit）：

对于单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng(0.03 pmol)

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng(0.06 pmol)

例如，将长度为 2 kb 的插入片段克隆至长度为 5 kb 的克隆载体时，克隆载体的最适使用量为：0.02 × 5,000 = 100 ng；插入片段最适使用量为：0.04 × 2,000 = 80 ng。

5、大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的转化：

(1) 取 50 µl 冰浴上融化的大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，加入克隆载体连接反应后的混合液体，轻柔混匀，在冰浴中放置 30 min。

(2) 42 ℃ 水浴热激 80 s，然后快速将大肠杆菌转移到冰浴中 2 min，该过程切忌晃动离心管。

(3) 向每个离心管中加入 250 µl 无菌不含抗生素的 LB 液体培养基，混匀后置于 37 ℃，200 rpm 培养 1 小时，使大肠杆菌复苏。

(4) 吸取 150 µl 的已转化的感受态细胞涂布于含卡那霉素的 LB 固体琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。

(5) 将平板置于 37 ℃ 至液体被吸收，倒置平板，37 ℃ 过夜培养。

(6) 挑取单克隆，在 1.5 ml 离心管中加入卡那抗生素的 LB 液体培养基 800 µl，置于 37 ℃，200 rpm 培养 6 小时。然后进行菌液 PCR 检测。

(7) 菌液 PCR 检测阳性的菌液可送至测序公司进行双向测序，若测序结果可与所构建的载体序列比对一致，说明过表达载体构建成功。

(8) 可将载体构建成功的菌液继续培养，然后使用质粒提取试剂盒进行质粒提取。提取的质粒载体可用于下游实验。

1. 选取的两个限制性酶切位点不能也存在于目的基因的 CDS 序列中。

2. 设计带有内切酶位点的引物时，输入的载体序列、插入片段序列以及选择的两个酶切位点先后顺序，一定都是按照 DNA 正义链的 5』至 3』方向。

3. 同源重组是一种高效的无缝克隆技术，使用同源重组反应体系时，应严格按照载体长度和插入片段长度去计算两者用量，以提高同源重组效率。

4. 感受态细胞转化的整个操作均需在冰上进行，但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 10%，并且使用的试剂和试剂管均需灭菌。

1. 如何判断是否双酶切成功？

取少量酶切后的质粒载体，跑琼脂糖凝胶电泳。观察条带，若酶切后的质粒载体两条条带，且符合酶切后线性载体大小，则表示酶切成功。

2. 菌液 PCR 检测无条带？

有可能是菌液浓度过低，建议菌液摇至明显浑浊再进行菌液 PCR 检测。也有可能引物使用错误，建议排查引物。另外也存在假阳性的可能，建议多挑几个菌落进行培养检测。

3. 胶回收的线性载体浓度低?

建议多做几个反应体系，并且多管反应液混合至一孔跑胶、回收。