真相揭秘 | 为什么构建稳定表达细胞株这样难？

别说话

先了解一下

外源基因在细胞中的表达可分为两大类。

 

一、瞬时表达

瞬时表达外源DNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平表达，但通常只持续几天。瞬时表达所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。

 

二、稳定表达

稳定表达外源DNA整合到宿主细胞染色体上，或者相当于附加子可持续存在，可使宿主细胞长期表达目的基因。

 

然而，外源基因整合进宿主染色体上的几率很小，通常发生随机整合，其表达水平和整合位置有关，会受周围染色体元件的影响。

 

 因此，要获得高产的稳定表达细胞株往往需要进行大量的筛选。

 

 

好在，还有给力的筛选系统可供选择。

 

G418 筛选系统

G418 筛选系统是稳定表达细胞株最常见的筛选系统。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当载体上的neo基因被整合进真核细胞基因组合适位置后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。neo基因为非扩增性选择基因，不影响目的基因拷贝数。G418筛选系统已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用，与之作用原理相似的还有潮霉素和嘌呤霉素筛选系统。

而在生物医药领域中主要是利用CHO细胞的GS或DHFR 筛选系统进行抗体药物、重组蛋白等的生产。

 

CHO表达系统

CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其他表达系统相比，它具有许多优点：表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化；准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；贴壁生长，有较高的剪切力和渗透压耐受能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到100 L以上。

                                                        

改造 CHO细胞可更好地表达外源蛋白，外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。

 

DHFR基因扩增系统

DHFR基因扩增系统最常用，当携带DHFR基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带DHFR基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-DHFR-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，DHFR可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与DHFR串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于DHFR基因本身，即与DHFR基因相邻的DNA区域同时被扩增。

但是，它却有以下缺陷。

 

表达细胞仅限DHFR缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从100～1000kb不等。即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。

 

然而，出现了更有效的扩增系统—GS扩增系统——GS（谷氨酰胺合成酶）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率。

 

这是为什么？

谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下，加入谷氨酰胺合成酶抑制剂甲硫氨酸亚砜（MSX）,可使GS 基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的，由于只有多拷贝的GS 编码基因才能抗MSX, 所以在转染过程中不必使用GS 缺陷型的受体细胞，而且在正常MSX 浓度下就能筛选到含高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS系统比DHFR 系统优越之处，主要哺乳动物细胞株为CHO-K1细胞。

 

加压扩增外源基因表达，除了单纯使用DHFR扩增系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用DHFR扩增系统与GS扩增系统共加压。

 

你以为这就完了？
No 还有更多筛选系统等你来膜拜

 

1）Flp-In系统

 

产生背景

随着新技术的不断革新，针对真核质粒转染构建稳定表达细胞株的方法也不断地创新，出现了TALEN、IOS、Cas9和Flp-In等技术，不断地提高稳定表达细胞株构建的成功率。

Flp-In系统——以其独特的优势，广泛应用于构建过表达或静默特定基因的稳定表达细胞株，用于特定基因的功能研究。Flp-In系统依据酿酒酵母的DNA重组系统的特点，高效构建稳定哺乳动物表达细胞株。这种DNA重组系统应用重组酶（Flp）和定点重组技术，将目的基因插入到哺乳动物指定的基因组中。它的优点是能构建同基因型的稳定细胞株，可以是多克隆稳定细胞株，无需单克隆筛选。

 

2）UCOE系统

产生背景

在G418、GS及DHFR三个筛选系统中，由于外源基因与宿主基因组发生的是随机非同源重组，当外源基因整合位置处于非转录活跃区或不稳定的区域时，外源基因会发生静默表达。为了克服位置效应带来的影响，提高筛选成功率及外源基因表达量，研究者通过基因工程的手段对表达载体进行改造。

UCOE系统——是Millipore公司推出的一套表达筛选系统，UCOE是一个小的DNA片段，源于看家基因的调控区域，可以有效防止基因沉默，不论外源基因整合到染色质什么位置，目的基因都能持续稳定高水平表达，成功地克服了位置效应的影响。该技术可以结合其他筛选系统的抗性基因或选择标记进行筛选。

筛选很重要，但实验流程也不能忽视。
 

 一、载体构建

首先，构建含目的基因的重组表达质粒。外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的，同时质粒DNA上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件。尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被用来将外源基因导入动物细胞，但是工业上在构建细胞株的过程中极少用到病毒来源的载体。 目的基因可以由组成型，诱导型或条件型启动子进行启动转录。在细胞分化和发育的研究中经常用到条件型启动子，它可以由某些特定因素引发，导致蛋白表达，影响细胞的分化。但是在重组蛋白的生产中，绝大多数表达载体使用强组成型的启动子。通常病毒来源的启动子，如SV40晚期启动子和CMV启动子，应用最为广泛。近年来，CHO来源的EF-1和GAPDH的启动子也被应用到蛋白生产中。 此外，密码子优化也可以提高基因的翻译水平。表达载体除了包含启动子、增强子和目的基因外，还需要有筛选标记基因或扩增标记基因，用于后续筛选。

 

 二、细胞转染

通过质粒将目的蛋白的编码基因导入到细胞内。使用的转染方法主要有DNA-磷酸钙共沉淀法，电击法，脂质体法。

 
三、目的蛋白初步检测

转染后应先确认转染效率和蛋白表达情况。

 

四、药物筛选

应该在转染后24 h 至48 h 后再加药筛选。过早加药抗性基因没有获得足够表达，细胞会发生大量死亡；过晚加药阴性细胞会大量生长。在哺乳动物细胞中质粒不能进行复制，未整合到基因组中的质粒会随着细胞分裂逐渐丢失。在一段时间的选择压力后，所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。这个阶段获得的稳定表达细胞株基本是混合克隆细胞株，其细胞间生长速率及基因型存在差异。当需要去除细胞群体干扰因素或需要持续稳定高表达目的蛋白时，推荐使用单克隆稳定细胞株。

五、目的蛋白再次检测

 

六、单克隆筛选及鉴定

单克隆来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增。单克隆筛选是稳定细胞株筛选的关键步骤。最常用的单克隆筛选方法是LDC法（有限稀释法）。虽然这种方法费时费力筛选效率低，但是由于它操作简单成本低，依然是最普遍使用的方法。

 

什么是LDC 法？

首先将细胞悬液稀释到很低的密度，然后铺96孔板，使每个孔平均接种1个细胞。通过显微镜观察，如果单个细胞一直是活的，且保持分裂状态，随后它便可能产生一个克隆。通常2至3周的时间便可以观察到克隆的形成。不同种类的细胞形成克隆的特性不同，对于某些脆弱的细胞可以适当提高铺板的细胞数，来克服细胞最低生长密度的限制，铺板时尽量使用分散的单个细胞悬液，避免细胞团的存在。单克隆形成后，需要结合Elisa、WB等检测方法对单克隆进行筛选鉴定，对产量高生长状态好的单克隆进行逐级扩大培养。

随着流式细胞分选技术的兴起，基于流式细胞仪的单克隆筛选方法也不断涌现。主要分以下三类技术：

细胞表面分子展示技术

通过共表达细胞表面捕获分子来筛选高产克隆株。首先可诱导表达一种膜锚定蛋白，该蛋白可以结合分泌型目的蛋白，再通过检测抗体的信号强弱实现对高产克隆的分选。

胞内报告蛋白技术

对于缺乏合适膜表面筛选标记的细胞也可以利用胞内报告蛋白进行筛选。例如GFP基因，表达绿色荧光蛋白，同样可以和目的基因共表达。大量研究表明，荧光信号的强度和目的蛋白的表达水平存在一定的正比例关系。因此可以通过判断绿色荧光的强弱来筛选高产细胞株。

亲和力捕获表面展示技术

将细胞表面进行生物素标记，通过亲和素作为桥梁能够将很多生物素化的抗体结合在细胞表面，生物素化抗体可特异性结合分泌目的蛋白，再通过荧光标记的检测抗体将信号逐级放大。其中，将细胞培养在高粘度的培养基中最大限度地避免了细胞间的交叉反应。

基于流式细胞仪分选技术的单克隆筛选方法能实现高通量筛选，效率高，但有时筛选的荧光信号高的细胞并不是绝对的高产量细胞株。除了流式细胞仪分选外还有一些全自动的单克隆筛选仪器可供选择。

 

七、扩大培养

对单克隆进行筛选鉴定后需要对产量高生长状态好的单克隆进行逐级扩大培养。

八、稳定表达细胞株定性定量检测

 

九、稳定表达细胞株质量控制

稳定表达细胞株质量控制应主要从以下三个方面进行考虑：（1）操作因素的影响：比较冻存前后细胞生长状态、活率及目的蛋白表达水平的变化。（2）传代/扩增过程的稳定性：可将复苏的库细胞连续传代培养至一定的代次和将工作库细胞在模拟实际生产条件下连续培养、扩增（逐级放大扩增过程），直至预期培养时间以及超过预期时间之外的延长时间点，收获后进行检测分析。通过考察目的基因、表达框架等在重组工程细胞中的传代稳定性和目的产物表达的稳定性，制定库细胞的限传代次和生产细胞的增殖限度以保证实际生产过程中细胞整体扩增水平。（3）安全性考察：应定期对细胞库和工作过程中细胞进行细菌、真菌和支原体检测。用于生物药生产的细胞株还应对细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒进行检测。

十、冻存细胞工作库

稳定表达细胞株筛选周期长，一般在3个月左右。在整个筛选过程中要对关键步骤获得的细胞进行冻存。对用于生物医药生产的细胞株，在选定生产用细胞株之后，需要建立主细胞库（mater cell bank）。从主细胞库复苏后，扩增建立工作细胞库（working cell bank），工作细胞库用于生产。细胞库通常保存在液氮中，需要维持整个产品的生命周期。

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