【交流】构建ShRNA表达质粒咋就那么难？

到医院实习之前，我有幸跟随我的恩师，利用课余时间做了两年多的基础科研。从不懂规矩到渐入佳境，期间学习了很多东西，在此感谢我的恩师！

我们是生物化学教研室，这两年的时间里我做了很多生化方面的实验。像细菌培养、细胞培养、PCR、western-blot、MTT测细胞增殖能力，这些实验都有商品化的试剂和推荐的操作方法，做起来，难度并不大。唯独让我感到苦恼的就是ShRNA表达质粒的构建这部分，它耗费了我们很多的精力，虽然最终取得了成功，也发表了论文。但是显然，这个实验的可重复性并不理想。

我一共做过四五个重组质粒，其中插入片段，大的有2000bp左右的，小的也有200bp左右的。其中200bp~900bp的不大不小的片段相对好做，2000bp的难度相对较大。而其中最难做的恐怕就是ShRNA表达质粒了，RNAi技术这些年是一个热点，但是把一个只有63bp的小片断DNA插入到4000bp~5000bp的质粒DNA当中，并不是一件容易的事情。期间我们做了近百次的尝试，总结出这么一些经验：

1、质粒酶切方式的选择。现在看来，如果质粒的条件允许，最好选择双酶切。因为双酶切操作相对简单，而分步酶切需要两次从切下来的琼脂糖凝胶中回收DNA 片段，其最终产量和浓度实在难以提高。

2、切好的质粒DNA 片段和目的DNA 片段的比例。由于分子量相差悬殊，设定两种片段的摩尔浓度确实是一件让人头疼不已的事情，我们发现，质粒DNA 片段和目的DNA 片段按照摩尔比1:3、体积比7:1的比例混合，使得最终混合液中质粒DNA的浓度和试剂盒法所提取的质粒DNA的浓度接近，连接酶连接的成功率将比较高。

3、转化和培养。质粒重组是否成功，往往要等转化结束之后才能知晓。而转化过程中一不留神，恐怕就要全部重新开始，因此十分重要。要提醒的是这么几点：1.感受态细菌的活性很重要，最好是当天制作当天使用。2.抗生素的使用。种类、剂量都不能错，否则就会出现假阳性或假阴性的结果。3.超净工作台、无菌操作十分重要，理由和上一条的相同。4.转化完成后可以先在无抗生素的LB中培养一段时间（1~2h），然后再加入到有抗生素的LB中继续培养，这样可以提高细菌的存活率。

4、酶切鉴定。由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率有限，小于100bp的小分子DNA已经很难看到条带。而我们的目的DNA只有63bp。因此我们对实验方法经行了改进：1.增加琼脂糖凝胶中DNA染色剂（EB或godview）的使用量，使DNA染色达到饱和。2.提高琼脂糖凝胶的浓度至3％（常规为1％）。但是随着琼脂糖凝胶浓度的提高，其黏稠度增加，融化过程中产生的气泡不易排除，因此建议凝胶融化后不要立即拿出来冷却，而是放在75℃的恒温水浴箱中静置，待气泡减少后再行灌胶。经过上述的一些处理，我们在酶切鉴定中成功地看到了长度为63bp的那条DNA 片段。

以上只是一些个人的想法和做法，必然有很多不科学的地方，希望各位大虾不吝赐教，指点迷津。