PCR产物双酶切构建载体，为啥很多假阳性？？？

主要考虑以下几点原因：

1、模板：①模板中含有杂蛋白质；

②模板中含有Taq酶抑制剂；

③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白；

④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；

⑤模 板核酸变性不彻底。

2、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

3、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。

1. 你的PCR有没有阴性对照? 是否样本有目的条带而阴性对照没有, 那就有可能是特异性不好等原因; 如果没有阴性对照或者阴性对照也有目的条带, 则有可能样本是污染了.

2. 双酶切的时候质粒的量是否足够. 如果目的条带比较小, 而切的量不多, 也有可能切出的目的片断太弱而很难观察到.

3. 是否在连接的时候双酶切中的某个位点产生突变, 从而切的时候实际上是单酶切效果. 所以肯定不会有目的条带的.

4. 其实做个对照很容易看有没有连接上的. 同时做一个双酶切和两个酶单独的单酶切后跑胶, 如果单酶切都能切开,说明酶和位点没问题, 如果双酶切的骨架片断比单酶切的要小, 说明质粒连入了外源片断, 而你的PCR能扩出目的片断, 阴性对照良好, 则基本能证明已经正确连入了. 拿去测序就知道序列正确与否。

增加pcr的量，目前考虑可能是样本太低。

根据你的描述，PCR产物的条带大小一致，说明引物1与载体的酶切位点设计正确，PCR产物也经过了酶切。但在提取质粒后进行酶切时没有目的条带，这可能是由以下原因导致：

酶切反应失败：在酶切反应中可能存在酶的降解、酶的不完全消化、酶切反应时间过短等问题，导致酶切反应失败。建议重新进行酶切反应，延长酶切时间或更换酶切体系。

质粒质量问题：质粒在提取、纯化的过程中可能存在质量问题，如质粒被降解、DNA含量不足等，这可能导致酶切反应失败。建议重新提取纯化质粒并进行质检。

酶切位点有变异：由于酶切位点是通过引物1设计的，因此在PCR扩增的过程中，酶切位点有可能发生变异。建议重新设计引物1，或者对扩增产物进行测序确认酶切位点的准确性。

综上所述，建议重新进行酶切反应，确保酶切反应成功，同时对质粒质量进行质检，并根据需要重新设计引物1。