载体质粒DNA与PCR扩增产物的限制性核酸内切酶酶切与连接

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一、目的
掌握DNA 体外重组 技术中限制性核酸内切酶的酶切与连接方法。了解酶解反应与连接反应的条件及原理。
二、原理
（一）酶切反应原理
1.核酸限制性内切酶 能够专一识别DNA双链上某碱基顺序，如EcoRI酶的识别顺序为：

若用EcoRI 酶切只有一个切点的环状双链DNA 分子 ，就能产生两个带有AATT 碱基顺序
的粘性末端的线状DNA分子 ：

若用EcoRI 酶切只有一个切点的环状双链DNA 分子 ，就能产生两个带有AATT 碱基顺序
的粘性末端的线状DNA分子：
EcoR I酶切→ AATTC——— G 5’
5’G ———CTTAA
若用EcoR I 和HindIII同时酶切，质粒介于这两个位点之间的一个小片段就会被切除，
而产生两个不同碱基顺序的粘性末端的线状DNA分子：
AATTC——— A 5’
5’G ———TTCGA
我们知道如果设计单位点酶切，质粒DNA 与PCR 扩增产物都会产生两个相同的粘性突出末端的线状分子，通过连接，就会产生不同方向性连接的重组质粒，也就产生了另一个问题，不同方向性的连接产生的结果一样吗？，为了避免这个问题，所以我们的实验设计了两个位点酶切，保证了连接的单向性。
2.核酶限制性内切酶作用于底物DNA 时，受到许多要素的制约，主要有以下几个：
1）底物DNA 样品的纯度：在制备DNA 样品中，由于各种条件的影响，存在着一些非DNA 物质，这些物质有的对酶切反应影响较大，如抽提过程中，有机物质的残留成份：酚、氯仿、酒精，都会破坏酶的活性，另外未除去的蛋白质，也会干扰酶的反应，残留的染色体DNA 则会相对降低酶对底物DNA 的浓度。
2）离子浓度：限制性核酸内切酶专一性需要镁离子，以作为辅基。并且要求一定的盐离子浓度，在使用上，通常把限制性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类：高盐、中盐和低盐，它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L 和O。如果离子浓度使用不当，酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变，例如高盐类的EcoRI 酶当Na+离子浓度低于50mmol/L时，它的专一性就降低。只能识别中间的4 个核苷酸序列（此活性记为EcoRundefined）
由于EcoRI 酶切反应需要高盐缓冲液，在中盐缓冲液中反应比较慢，HindIII 酶切反应需要中盐缓冲液，实验要求EcoRI 与HindIII酶同时消化DNA时，而酶切反应要完全，则选用了中盐缓冲液。中盐缓冲液虽然对EcoRI 酶的效果有一些影响，但总体上还是可行的。
还有一种方法就是先用中盐缓冲液的HindIII 酶酶切，再用高盐缓冲液的EcoRI 酶酶切，效果可以更好。但课堂实验受时间约束，所以选用了双酶切。