DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验

一）酶切实验
　　本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。
　　【原理】
　　λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322 DNA为人工构建的质粒DNA, 分子大小为4.3 kb，含有1个EcoR I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。
　　【材料】
　　1．λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA（0.25 ug/ul）
　　2．限制性内切酶EcoRI
　　3．EcoRI 酶切缓冲液（Buffer solution 10×）
　　4．去离子水
　　5．电泳及染色用材料
　　【方法】
　　1．取洁净EP管2只，按表10－1加入各成分。
　　2．混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。
　　（二）DNA连接实验
　　T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3�羟基和5�磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA
　　【材料】
　　1．λDNAEcoRI酶切片段
　　2．T4 DNA连接酶
　　3．T4 DNA连接酶缓冲液（10×）
　　4．去离子水
　　【方法】
　　1．取洁净EP管1只，分别加入：
　　①去离子水 7ul,
　　②T4 DNA连接酶缓冲液（10×） 2 ul，
　　③λDNA酶切片段（已65℃10分钟灭活）10ul
　　④T4 DNA连接酶1ul
　　2．混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。