DNA的限制性核酸内切酶酶切实验和连接实验

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DNA连接与转化

酶切实验

本实验学习用限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)EcoRI 切割λDNA及质粒 pBR322DNA，琼脂 糖凝胶电泳 后观察酶切结果。

【原理】

λDNA 是大肠杆菌 的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子 大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸 序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDNA切成6个大小不同的片断。pBR322 DNA为人工构建的质粒DNA, 分子 大小为4.3 kb，含有1个EcoR I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。

【材料】

1.λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA(0.25 ug/ul)

2.限制性内切酶 EcoRI

3.EcoRI 酶切缓冲液(Buffer solution 10×)

4.去离子水

5.电泳及染色用材料

【方法】

1.取洁净EP管2只，按表10-1加入各成分。

2.混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接 实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。

(二)DNA连接实验

T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端(Cohesive ends)，在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA

【材料】

1.λDNAEcoRI酶切片段

2.T4 DNA连接酶

3.T4 DNA连接酶缓冲液(10×)

4.去离子水

【方法】

1.取洁净EP管1只，分别加入：

①去离子水 7ul,

②T4 DNA连接酶缓冲液(10×) 2 ul，

③λDNA酶切片段(已65℃10分钟灭活)10ul

④T4 DNA连接酶1ul

2.混匀后，放13℃水浴过夜，待电泳检测。