酶切实验过程中遇到的问题？

从下面几个因素去考虑：1)　酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug λDNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用1λ DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.2)　模板性质是否清楚：如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的)，同时需要提高酶的用量（10U/ug）和延长反应时间等措施。3)　模板纯度是否够：模板制备方式影响DNA的质量，制备过程中使用到乙醇，氯仿，苯酚，SDS, EDTA等如果残留在最终的DNA模板中，都会不同程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提，需要的问题污染是变性剂和乙醇；如果是手工制备的，氯仿，乙醇，苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。4)　甲基化程度对酶的活性是否有影响：细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式，在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况，或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。5)　反应条件是否合适：对照说明书，检查使用的温度是否正确，是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。6)　酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，但是对同时做多个相同反应的时候，最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物，然后分装，最后加模板。需要提醒的是混合物中由于没有底物的存在，离子强度也不对，酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题，只是动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用。

一般商业化的限制性核酸内切酶效果还是可以的，先查一下对应的Buffer有没有用错。另外还可以考虑降低载体浓度，减小酶切体系，多做几管回收后合在一起，小体系酶切效率高一点。

首先看看是不是存在以下问题:

（1）缺少识别序列。

（2）反应条件不合适。

（3）限制性内切酶对DNA甲基化敏感。

（4）内切酶稀释不正确或加入方法不正确。

（5）甘油浓度过高。

（6）限制性内切酶已部分或全部失活。

对策：

（1）检查底物DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。

（2）使用随酶提供的反应缓冲液;增大酶量。

（3）检查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性内切酶是否对甲基化敏感。

（4）限制性内切酶经稀释缓冲液稀释后应在当天用完;限制性内切酶通常在最后加入。

（5）更换新酶进行实验。

（6）酶的体积不能超过反应总体积的1/10。

按照说明书的时间和浓度来，不要你认为多少是多少，如果按照说明书来还不行，那就是酶坏了

原因很多：

1.可能是酶切的时间不够。

2.可能是你用双酶切的时候buffer的体系两种酶不能发挥最大功效。

3.可能是用的酶量过高导致甘油量高，一般加酶的总量不超过总体系的10%。

4.可能是两个酶切位点离的非常近。

DNA切割不完全原因：
1) 内切酶活性下降
用5-10倍量过量消化

2) 内切酶稀释不正确
用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶

3) DNA不纯，反应条件不佳
同上

4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰
同上

5) 部分DNA溶液粘在管壁上
反应前离心数秒

6) 内切酶溶液粘度大，取样不准
将内切酶稀释，增大取样体积

7) 酶切后DNA粘末端退火
电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷

8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡

9) 过度稀释使酶活性降低
适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏

10)反应条件不适
使用最佳反应体系

11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
加大酶量5-10倍