免疫组化实验中遇到的问题分析

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如何实现完美的免疫组化实验

案例一：DAB染色后切片着色一片黄/背景深

背景：奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的Sp三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化 实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。

问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?

1、 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2、 一抗用多克隆 抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色;

4、 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫 血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果;

5、 DAB孵育时间过长或浓度过高;

6、 PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要;

7、 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

我的实际解决方案：

以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。

1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原 进行分析，这种因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育时间是否太长?做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min，我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。

3、最后，血清封闭的问题?以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。

4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作(我以前一般一抗4度过夜且室温复温45min、二抗37度30min、Sp反应37度30min)，以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。

我冷静地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。

5、我用PBS替代一抗稀释液(我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂)，其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致(包括血清也是老试剂盒内剩余的一点)，奇迹出现了：结果很好。--因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是PH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的PH值，结果是前者偏酸性(<6、0)，而后两者均在7、5左右。

6、看来主要祸根是抗体稀释液的PH值出问题了，于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，结果还是没有做出来：背景很深。这真把我搞惨了。难道还有什么原因吗?通过仔细分析：一抗一定是结合上去了(老SP试剂盒结果很好)，问题是二抗没有结合上去也不对(因为最后背景很深，这说明二抗可能也结合上去了)，DAB孵育时间现在只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又怀疑封闭血清了。

7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，其余试剂(二抗、SP)均用新试剂盒提供的，结果是前一张效果很好，而后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看来封闭血清也是罪会祸首之一。

结果分析显示：抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不佳，望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题。--惨痛的教训，值得引以为鉴。

案例二：DAB染色后切片着色呈阴性结果

背景：其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸(染色不均匀)。而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的。

问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?

1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果?另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3、组织切片本身这种抗原含量低;

4、血清封闭时间过长。

5、DAB孵育时间过短。

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

我的实际解决方案：

1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。(1)抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重(有文献支持)，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证(蜡块需要低温保存)。(2)石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6miundefined4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。(3)组织切片中本身抗原含量的多少?这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好;但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。

2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。(1)一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好;一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误;一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。(2)抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4度孵育过夜和37度复温45min;二抗我一般37度30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。(3)抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了，直接滴加)，重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好;而进口分装次之;工作液可能要注意质量问题。

3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min最好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。

4、最后，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。

5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。

6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的干扰。

总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。

案例三：石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果

背景：因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1(一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白)免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过(原理知道，但细节不太了解)。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想(表现为未见特异性强染色);近几日，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论)，不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光?其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测(我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。)

问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色?

1、非特异性染色产生原因及其解决方案：

(1)游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。

(2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

(3)组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。

(4)从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

(5)抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

(6)荧光素不纯、标本固定不当等。

(7)一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。

2、阴性染色产生的原因有：

(1)一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。

(2)荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。

(3)血清封闭时间过长。

(4)抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。

(5)组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。

(6)组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。

(7)荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。