🔥 免疫组化法

通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。免疫组织化学的显著特点是特异性强。

样品：冷冻切片；

试剂：一抗；二抗；三抗（生物素标记的辣根过氧化物酶卵白素）；PBS 缓冲液；多聚甲醛；

器材：DAB 免疫湿盒；滴管；剪刀；进口膜（parafilm）；37 ℃ 培养箱；移液枪及枪头；酶标笔（PAP）；光学显微镜

1. 将实验用试剂从 4 ℃ 冰箱取出，自然平衡至室温。

2. 将脑片从 -20/-80 ℃ 冰箱中取出，自然平衡至室温。

3. 用酶标笔在脑片周围画圈，防止液体在玻片上溢流。

4. 4% 多聚甲醛固定 30 min。

5. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

6. 0.4% Triton-X100/0.01 M PBS 洗，10 min，1 次。

7. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

8. 0.3% H₂O₂/0.01 M PBS 洗，10 min，1 次。

9. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

10. 以 10% 山羊血清（1:10，以 0.01 M PBS 稀释），37 ℃ 恒温箱放置 30 min，一般以 40 μl/脑片为宜。

11. 倾去封闭血清液，略干，加一抗，4 ℃ 冰箱放置过夜。

12. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

13. 加二抗（1:200 稀释度），37 ℃ 恒温箱放置 1 h，一般以 40 μl/脑片。

14. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

15. 加三抗（1:300 稀释度），37 ℃ 恒温箱放置 1 h，一般以 40 μl/脑片。

16. 0.01 M PBS 洗，5 min，3 次。

17. DAB 显色（DAB 配置：1 ml 水中，加 1 滴 A 液，混匀后，加 1 滴 B 液，再 1 滴 C 液），显色约 10 min。

1. 内源性生物活性及其消除生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基中间载体，在应用 ABC 法染色时会与抗生物素蛋白结合而产生非特异性染色。

对含内源性生物素或生物素样物质较丰富的组织，在应用 ABC 法前，应预先以 0.01％ 的抗生素蛋白和 0.01％ 生物素溶液分别作用 20 分钟左右，以消除内源性生物素活性。每次作用后应用 PBS 洗 5 分钟，更换 3 次。

此外，最近已有从链霉抗生素蛋白（streptavidin）由于其分子中不含寡糖及等电点接近中性（6~6.5），故非特异性吸附很低。同时链霉抗生素蛋白可与长臂生物素及过氧化物酶结合成复合物，此为 SABC（streptavidin-Biotin-peroxidase Complex）复合物，用 SABC 取代 ABC 进行标记，可提高灵敏度（比 ABC 高约 20 倍）及降低非特异性着色。

现在 SABC 已有成品的试剂盒出售。SABC 法的操作步骤基本与 ABC 法相同，只不过要用 SABC 代替 ABC 标记，即将 SABC 试剂盒中的 A 液、B 液各取 10 μl，加入 1 ml 的 PBS 中（临用前配，配好后立即加入切片中）室温孵育 30 分钟。此外第一级抗体和第二级抗体的孵育时间均可缩短至 30 分钟以内，故 SABC 法是一个快速、简便、敏感及非特异性着色低的检测方法。

2. 生物素制剂间相互亲和性差异很大，因此在应用 ABC 试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先预测，以保证实验结果的稳定性。

3. 标记过程中应始终保持组织切片的湿润。

4. 在 DAB 显示液中加入镍等金属离子，以使反应产物呈蓝黑色，并用甲基绿复染核，可加强阳性染色的对比度和提高灵敏度。

5. 在用 PBS 缓冲液冲洗的过程应尽量冲洗完全，片子表面不留杂质。

6. 准确配比抗体的浓度，因为浓度过高和过低都不利反应的进行，在滴加抗体的时候，做到用量少而均匀。

7. DAB 是有毒试剂，使用过程中尽量不污染周围环境，并且显色过程中尽量避免 DAB 见光分解。

8. 滴加每种试剂做到迅速准确，以免片子在反应中干燥。

9. ABC 试剂保存温度以 4 ℃ 为佳，据报告保存达两年之久，仍能获得满意效果，而在 -20 ℃ 度，生物活性在短期内即被破坏。