免疫组化SABC法与SV法

实验原理

SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。

亲和素(Avidin)存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱性蛋白质，具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌(Streptomyces Avidinii)培养物中所提取的蛋白质，分子量47000，不含糖链，等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样，也有四个生物素结合位点，亲和力高达10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。

生物素是一种水溶性维生素(即维生素H)，分子量244。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用，这是SABC具有高度敏感性的基础。

SV(Super Vision)两步法：是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强大的信号放大能力，同时有很强的组织细胞渗透力，经检测其灵敏度高于同类产品，特别是针对核抗原，其渗透性特别强，适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法比较具有简单，快速，高敏感，低背景等特点。

原理示意图：

实验试剂

1. 即用型SABC(过氧化物酶)试剂盒(博士德货号SA1021，SA1022)

2. 即用型SV(HRP辣根过氧化物酶)试剂盒(博士德货号SV0001，SV0002)

3. DAB(黄色，博士德货号AR1022)

4. Mayor`s苏木素(博士德货号AR0005)

5. 所选一抗：KCA3.1(BA1788)；PCNA(BM0104)；Vimentin(BM0135)( 博士德公司)

6. 3%H₂ O₂

7. 5%BSA封闭液

8. PBS缓冲液(PH7.2-7.6)

9. 饱和Na₂ HPO₄ 溶液

10. 中性树胶

实验设备

微波炉，37℃恒温箱，超薄切片机

实验材料

乳腺癌石蜡切片，肠癌石蜡切片，切片厚度为5微米

实验步骤

SABC法：

1. 切片脱蜡至水；

2. 新鲜配置3%H₂ O_{2 ，} 室温10分钟，灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次；

3. 微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置５分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却；

4. 滴加5%BSA封闭液，37℃反应30分钟。甩去多余液体，不洗；

5. 滴加一抗，4℃反应过夜。所配一抗的浓度为1µg/ml；

6. PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反应30分钟；

7. PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加试剂SABC，37℃反应30分钟，PBS洗30分钟×3次；

8. DAB室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；

9. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na₂ HPO₄ 溶液中2分钟，取出后洗涤，37℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。

SV法：

1. 切片脱蜡至水；

2. 新鲜配置3%H₂ O₂ ，室温10分钟，灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次；

3. 微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置5分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却；

4. 滴加5%BSA封闭液，37℃反应30分钟。甩去多余液体，不洗；

5. 滴加一抗，4℃反应过夜，所配一抗的浓度为1µg/ml；

6. PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加HRP标记二抗IgG (抗兔或抗鼠)37℃反应30分钟，PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗30分钟×3次；

7. DAB室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；

8. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na₂ HPO₄ 溶液中2分钟，取出后洗涤，37℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。