构建 SV40衍生载体

构建 SV40衍生载体

材料

试剂
COS-7 细 胞（A T C C )

在 75 cm2 的细胞培养瓶中用 DMEM-IO 培养细胞，每 3〜4d 传代一次。
氯 化 铯 梯 度 溶 液（1.28 g/m l 和 1.50 g/m l)

分别将 3 〇 g 和 40 g 固体 CsCl 溶解于 70 ml 和 50 ml 的 0• 02mol/L Tris-HCl (pH 7. 4 ) 中。分别 取 Im l 的每种溶液，用分析天平称重确定密度。使 用 〇.22Pl 滤膜过滤灭菌。

双去污剂

5 % 去 胆 酸 盐（Sigma-Aldrich)

10% Triton X-IOO (Sigma-Aldrich)

Dulbecco 基本培养基（D M E M ; G I B C O B R L )

使 用 0.22um 滤膜过滤灭菌。

乙 醇（70% V /V )

F u G E N E -6 转 染 试 剂（Roche)

生长培养基（p H 7. 4) (D M E M -10)

D M E M

1 0 % 正常小牛血清（C a m b r e x)

1 % 青霉素/链 霉 素（Cellgro)

1 % L -谷 氨 酸（Cellgr0)

使 用 0. 22um 滤膜过滤灭菌。

维持培养基（p H 7. 4) (D M E M -2)

D M E M

2 % 正常小牛血清（C a m b r e x)

1 % 青霉素/链 霉 素（Cellgro)

1 % L -谷 氨 酸（Cellgr0)

使 用 0.22pm 滤膜过滤灭菌。

10 X 磷酸盐缓冲液（P B S )

2 g K C l

80 g NaCl

14.4 g N a 2 H P 0 4

2.4 g K H 2P 0 4

溶解于 IL 双 蒸 水 WdH2O)。使用前，用双蒸水将 10 X 储液稀释成 I X PBS。调 整 pH 为7.4。使 用 0. 22pm滤膜过滤灭菌。

rSV40 DNA

包含所需转基因的病毒基因组 DNA 从载体质粒中切除得到，胶纯化，然后使用标准技术重新环化。

胰酶/ E D T A (Cellgro)

水 ，双蒸水

仪器

细 胞 刮 刀（灭菌，单独包装）

离 心 管（塑料，清洁，且透明；B e c k m a n )

使用前，室温下使用 70% 乙醇浸泡离心管至少 15 min 灭菌。

C O 2 培 养 箱（维持 37°C ， 5 % 〜6 % C 0 2; N A P C O )

冻 存 管（I.5m l ; Nalgene)

透析浮标和透析卡（0.5〜3. O m l ; Pierce)

滴定复制缺陷型的 rSV40

材料

28.使用下面的公式计算每毫升的病毒颗粒数：
初始拷贝数 X 5X 500 = 病毒拷贝数 Anl

29.根据解离曲线验证样品的纯度。一个单峰表明是一个 PCR 产物。
PCR 产物的纯度和大小也可以根据琼脂糖凝胶电泳来确定