两种免疫组化方法之SABC法与SV法比较

互联网2013-09-06

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SABC法：ABC代表的是亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC(链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物)就是StreptAvidin Biotin Complex的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。

基本原理：亲和素(Avidin)存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱性蛋白质，具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌(Streptomyces Avidinii)培养物中所提取的蛋白质，分子量47000，不含糖链，等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样，也有四个生物素结合位点，亲和力高达10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。

生物素是一种水溶性维生素(即维生素H)，分子量244。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用，这是SABC具有高度敏感性的基础。

SV(Super Vision)两步法：是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强大的信号放大能力，同时有很强的组织细胞渗透力，经检测其灵敏度高于同类产品，特别是针对核抗原，其渗透性特别强，适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法比较具有简单，快速，高敏感，低背景等特点。

原理示意图：

用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物

现对这两种方法进行比较：

一.材料

所选试剂：

即用型SABC(过氧化物酶)试剂盒(博士德货号SA1021，SA1022)

即用型SV(HRP辣根过氧化物酶)试剂盒(博士德货号SV0001，SV0002)

DAB(黄色，博士德货号AR1022)

Mayor`s苏木素(博士德货号AR0005)

所选一抗：

KCA3.1(BA1788);PCNA(BM0104);Vimentin(BM0135)

注：抗体来源均为博士德公司

所选组织片：乳腺癌石蜡切片，肠癌石蜡切片，切片厚度为5微米

二.操作步骤

SABC法：

1.切片脱蜡至水

2.新鲜配置3%H2O2，室温10分钟,灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次

3.微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置5分钟，拿出室温冷却6分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却

4.滴加5%BSA封闭液,37℃反应30分钟。甩去多余液体,不洗

5.滴加一抗，4℃反应过夜。所配一抗的浓度为1µg/ml

6.PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反应30分钟

7.PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加试剂SABC，37℃反应30分钟，PBS洗30分钟×3次

8. DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤

9. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取出后洗涤，37℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。

SV法：

1.切片脱蜡至水

2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟，灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次

4.滴加5%BSA封闭液，37℃反应30分钟。甩去多余液体，不洗

5.滴加一抗，4℃反应过夜，所配一抗的浓度为1µg/ml

6.PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次，滴加HRP标记二抗IgG (抗兔或抗鼠)37℃反应30分钟，PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗30分钟×3次

7.DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤

8. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取出后洗涤，37℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。

三.结果比较

四.结论

SABC法的特点：

1.稳定性好：链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小。因此，SABC法在实际应用中，稳定性高，减少了操作误差，提高了检测的精确度

2.特异性高：链酶亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度特异性。因此，SABC法的多级放大作用不仅可以提高检测的灵敏度，同时还避免了非特异性干扰

3.高敏感性：生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成生物素衍生物结构，该结构具有保持大分子物质的原生物活性功能，同时，每个链酶亲和素分子有四个生物素结合部位，可以多价形式同时结合生物素化的大分子衍生物和酶标记物。因此，SABC法具有多级放大作用，使其在免疫组化实验时大大地提高检测方法的灵敏度

SV法的特点：

1.背景染色低：由于不用亲和素，避免了内源性生物素干扰，减少了假阳性、降低了背景染色

2.操作简便快速：仅需进行两次抗体孵育，更为简单、快速

3.核抗原染色强：多聚酶紧密连接在免疫球蛋白分子上，由于没有惰性多聚物骨架总体分子量相对较小，克服了大分子复合物穿透力弱、核抗原不易染色的缺点

4.敏感性较高：显色结果可以达到比较满意的效果

总结上述特点，SABC法与SV法各有优势，可根据自身的实验条件选取合适的实验方法