免疫组化SP法步骤

SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。

按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原―抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。

一般的sp法步骤啊,具体如下：

1. 烤片，68 ℃，20分钟,

2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20 min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10 min --100%II 10 min --95% 5 min-- 80% 5 min-- 70% 5 min

3. 阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H₂O₂ 37 ℃孵育10 min，PBS冲洗3X5 min；

4. 抗原修复:置0.01 M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95 ℃，15－20 min），自然冷却20 min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5 min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37 ℃10 min，倾去勿洗.

6. 滴加一抗4 ℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3X5 min;

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3X5 min;

8. DAB/ H₂O₂反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。