流式细胞仪法分选法分离纯化 SP 细胞

分离肿瘤干细胞的主要思路与分离成体干细胞的思路类似，包括根据特殊的表面标记分子进行分选和 SP 细胞分离。SP（side population）细胞又称为边缘群细胞。用结合 DNA 的荧光染料 Hoechst 33342 处理细胞，利用肿瘤干细胞可将染料泵出细胞的性质，经过荧光活化细胞分选系统（fluo-rescence activated cell sorting，FACS）的分析，将不被染色或低染色的肿瘤干细胞筛选出来。已经有报道从肿瘤细胞系和实体瘤中都能分离出 SP 细胞，并且这群细胞具有肿瘤干细胞的特征。

荧光激活细胞分选法分离纯化肿瘤干细胞的原理是携带荧光素标记的待检细胞混悬在一定容积的上样缓冲液中，进样后仪器将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。荧光标记的细胞通过仪器的激光束激发照射时，产生的荧光信号通过敏感的光电倍增管被光学系统检测到，并输送到计算机进行分析处理。

器材：

① 流式细胞分选仪

② 一次性无菌移液管

③ 15 ml 和 50 ml 离心管

① 1000xHoechst 33342 储存液

② 1000xPI 储存液

③ 1xHBSS

④ 青霉素

⑤ 链霉素

⑥ 胎牛血清

⑦ TC199 培养基

流式细胞仪法分选法分离纯化 SP 细胞的基本过程可分为如下几步：

（1）1000xHoechst 33342 储存液（5 mg/ml，-20 ℃ 长期保存）。

（2）1000xPI 储存液（2 mg/ml，-20 ℃ 长期保存）。

（3）组织保存液的配制 TC199 培养基，100 ml；青霉素（10000 U/ml），4 ml；链霉素 (10000 μg/ml),4 ml。 用 0.22μm 滤器过滤除菌。4 ℃ 保存，1 个月内使用。

（4）流式洗液的配制 1xHBSS，200 ml；胎牛血清，4 g。用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，1 个月内使用。

乳腺癌手术样本，浸泡在样品保存液中，分离前 4 ℃ 保存，最长时间不超过 24 h。

（1）按实体肿瘤细胞培养章节的方法分离乳腺癌单细胞悬液，按 1x107 个/ml 的细胞浓度重悬在 1xHBSS 中。

（2）按照 5 μg/ml 的终浓度逐滴加入 Hoechst 33342，轻轻混匀。

（3）37 ℃ 温箱中孵育 90 min。

（4）200 g 离心 10 min。

（5）去除上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团。用流式洗液重悬细胞，细胞浓度调整为 106 个细胞 / 0.5 ml。

（6）按照 2 μg/ml 的终浓度滴加 PI 染料，置于冰上，避光，待上机。

（7）从乳腺癌组织中分离 SP 细胞的阳性率较低，一般在 1％ 左右。

对分选获得的细胞进行细胞计数，并进行肿瘤干细胞生物学鉴定。

（1）乳腺癌手术样本取材时要注意材料越新鲜，肿瘤干细胞分离成功的概率越大，一般样本必须在外科手术 1 h 之内得到。手术或活检切取的样本应尽早浸入无血清的培养基（用 M199，RPMI1640 等基础培养基均可，可适当添加青霉素或链霉素，减少污染）中保鲜。此外应注意取未经治疗和没有坏死的标本进行分离为宜。

（2）流式分选前，取出一小部分细胞进行计数，观察细胞是否仍保持单细胞，若观察到有细胞成团，用 40 μm 尼龙网过滤，避免成团的细胞影响流式细胞仪分选。