🔥 免疫组化主要步骤

载玻片、显微镜、组织切片

1. 洗载玻片： 将载玻片置于重铬酸钾和浓 H2SO4 混合液中， 目的是为了是载玻片上的硅胶等除去， 同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整， 便于组织吸 附， 然后置于清水中清洗， 除去残余的重铬酸钾和浓 H₂SO₄（大约冲一个小时左右）， 再将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上， 置于 37 °C 温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于 Lys 带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2. 包埋组织： 先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5 µm, 如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40 °C 温水中。

4. 捞组织：当组织载玻片置于 40 °C 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片 捞组 织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5～6 张，其中 2～3 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比 较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37 °C 温箱中烘干。

5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100% 酒精-100% 酒精-95% 酒精-90% 酒精-80% 酒精-70% 酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯， 依据 的是相似相溶的原理。 一般在每个试剂中放 10 min, 天气热可以少放几分钟， 相反， 天气较冷的话， 就要适当延长脱蜡时间， 一般为 12～15 min.

6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入 3% H₂O₂ 浸泡 10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉 H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸 缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

7. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中 5 min，洗 2 次，擦干组织周围的 PBS 液，马上加上血清，使一些非特异 性的位点封闭起来，然后放入 37 °C 温箱中半小时。血清稀释 10 倍（900 µl PBS：100 µl 血清封闭 液）。

8. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS。加完一抗后于 4 °C 冰箱中保存过夜。

9. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上二抗， 然后置于 37 °C 温箱中半小时。

10. 加 SABC: 将片子从温箱中取出， 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上 SABC, 然后置于 37 °C 温箱中半小时。SABC 稀释 100 倍（990 µl PBS：10 µl SABC）。

11. 加显色剂：将片子从温箱中取出， 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上显色剂。（显色剂的配置：在 1 ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加 1 滴显色剂 B，摇匀， 再加 1 滴显色剂 C，摇匀）A：DAB， B：H₂O₂ C：磷酸缓冲液。

12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织 3～5 min。

13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70% 酒精-80% 酒精-90% 酒精-95% 酒精-100% 酒精-100% 酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置 2 min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。