🔥 免疫组化染色实验（IHC）

免疫组织化学技术是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

检测组织中某蛋白的表达，包括其表达与否、表达位置和相对含量。

1. 1xPBS 缓冲液（pH 7.2～7.4）：NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L,Na₂HPO₄ 4.3 mmol/L, KH₂PO₄ 1.4 mmol/L。

2. CB：柠檬酸三钠 3 g， 柠檬酸 0.4 g。

3. 1% 盐酸酒精分化液：按体积比为浓盐酸：无水乙醇 = 1:99 配制。

4. NGS：正常山羊血清，10% 及 1% NGS 用 1xPBS 稀释。

5. 苏木素染色液：苏木精粉 0.5 g，铵矾 24 g，蒸馏水 70 ml，NaIO 31 g，水 5 ml，再加入甘油 30 ml 和冰醋酸 2 ml，混合均匀，滤纸过滤。

6. 一抗、二抗按需选择购买，尽量参考高分文献。

仪器：烤片机、通风橱、免疫组化染色缸或盒、微波炉、湿盒、显微镜、微波炉。

（若非石蜡切片直接进行第 4 步梯度水化即可）

（若为冰冻切片，则进行以下步骤后直接进行第 5 步内源性过氧化物酶阻断：

一、样本处理

1、加固定剂（按下述固定剂选择固定条件）：

10% 中性缓冲福尔马林：在室温下固定 10 min。

冷冻丙酮：-20 ℃ 冷冻 10 min，风干。

甲醇：-20 ℃ 冷冻 10 min。

3% 甲醛：室温下固定 15 min。

3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中室温固定 15 min，之后直接放入甲醇溶液中 -20 ℃ 固定 5 min。

2、1xPBS 清洗 2 次，每次 5 min。

二、IHC 流程

1. 选取质量较好，厚度均匀的组织切片并做好标记，同时设立一张阴性对照切片；使用不同抗体的切片尽量选取连续切片，避免因组织差别大而影响结果分析的客观性；

2. 石蜡溶解：将切片置于 70 ℃ 原位杂交仪中，烤片 30 min （无烤片条件也可忽略此步直接进行 ，适当增加脱蜡时间）；

3. 脱蜡：将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，2 次，各 5 min；

4. 梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min，蒸馏水中放置 5 min；

5. 内源性过氧化物酶阻断：滴加 3% 过氧化氢，室温于湿盒内放置 10 min 后，蒸馏水中放置 1 min；

6. 抗原修复：放置于 CB 中，微波炉 80% 火力 4 min，40% 火力 8 min，冷却至室温；

7.（可选步骤）0.3% Triton 室温通透 15 min；

8.  封闭：吸干组织周围液体，滴加 10% NGS，放置于湿盒内，37 ℃ 30 min 或室温 2 小时；

9.  一抗：按抗体说明书建议比例使用 1% NGS 稀释抗体；吸干组织周围液体，滴加稀释好的一抗，阴性对照组仅滴加 1% NGS，放置于湿盒内，37 ℃ 孵育 2 小时，或 4 摄氏度过夜；

10. 放置于 1xPBS 中清洗 3 次，每次 5 min；

11.  二抗：吸干组织周围液体，滴加二抗，主要分为以下两种：

A. 酶标法检测：滴加酶标山羊抗兔/鼠 IgG 聚合物（依据一抗种属来源选择），37 ℃ 孵育 20 min；1xPBS 清洗 3 次，每次 3 min。

B. 生物素化检测：滴加生物素标记山羊抗兔/鼠 IgG 工作液（依据一抗种属来源选择），37 ℃ 10～15 min；1xPBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加碱性磷酸酶标记链霉卵白素，37 ℃ 10～15 min。

12. DAB 显色：吸干组织周围液体，滴加适量 DAB 或 AEC 显色液，室温 5～8 min，显微镜观察颜色；

13. 核染：自来水冲洗后，吸干组织周围液体，滴加苏木素染色液，染色 5 min，流水冲洗掉苏木素染液，显微镜观察染色程度；

14. 分化：1% 盐酸酒精分化 1～3 s，水洗，置于自来水中浸泡返蓝 5～10 min；显微镜观察颜色，若颜色不够深可直接滴加苏木素染色液复染 1 min 后，再次分化立即水洗；若过深则适当增加分化时间；

15. 梯度脱水：80%、90%、95% 和 100% 乙醇进行脱水；

16. 透明：二甲苯 2 次，各 5 min，室温晾干；

17. 封片：滴加一滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24 h 后置于显微镜下观察拍照。

图 1. 皮肤 Col-XVII 的 IHC 结果示例，可看到皮肤上皮真皮紧密连接层 Col-XVII 阳性（棕色），蓝色为细胞核

https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1822552/v1 中 Fig.3 G

图 2. 泪腺组织 MIF 的 IHC 结果示例，棕色为阳性细胞，蓝色为细胞核 DOI：

https://doi.org/10.21467/ias.4.1.27-34

1.  注意充分脱蜡，脱蜡不彻底易造成染色难，染色不均匀，组织细胞结构层次不清晰。

2. 不同组织染色难易程度有差别，染色时注意镜检，灵活调整染色时间。

3. 可以将内源性过氧化物酶阻断步骤在抗原修复之后进行。

4. 确定蛋白表达位置，并与阴性对照对比，避免假阳性，部分蛋白（仅限 human）的 IHC 结果可参考 https://www.proteinatlas.org/.

1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象：

烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；用含有多聚赖氨酸的玻片制作切片；有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；用 CB 高温修复时，尽量避免 CB 沸腾，修复完成后自然冷却至室温，避免骤冷引起脱片。

2. 产生组织切片非特异性染色

① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；

② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗