科研新手，从入门到精通

以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

感受态细胞易于接受外来基因成为重组细胞，实验将质粒加入有感受态细胞的培养皿中，热击处理进行质粒转化。

活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

细胞迁移是指细胞在外界信号的作用下从一个位置（区域）移动到另一个位置（区域）的过程，这个过程在生物体内发挥着非常重要的生理和病理学作用，比如损伤修复、肿瘤转移、免疫细胞的迁移、组织修复等。

恶性肿瘤向邻近的组织侵犯称为侵袭。检测肿瘤侵袭能力是判断肿瘤转移能力的一种方法。

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。CCK-8 & MTT 方法比较方法优点缺点CCK-8 法灵敏度高、不使用有机溶剂、检测迅速、重复性好价格较 MTT 贵、CCK-8 试剂的颜色为淡红色、与含酚红的培养基颜色接近，容易漏加或多加MTT 法价格便宜操作步骤较多，需要使用有机试剂，灵敏度不如 CCK-8，多数需要配制，检测时间长，

一、包被抗原1. 用 50 mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为 10～20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶标板，4 ℃ 放置过夜。2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。FCM所有这些功能的实现依赖于一种特殊的仪器——流式细胞仪，它是综合了激光、电脑、流体力学、光学和荧光细胞学等先进技术的高科技产品。流式细胞术不仅可测

一、细胞和试剂的准备细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。荧光标记单克隆抗体：常用的有 FITC（fluorescein -isothiocyanate）和 PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。封闭抗体：抗 Fc 受体抗体 (注：如选择 REAfinity 重组抗体无需封闭，可省去此步骤)。FACS 缓冲液：1xPBS 950 ml / FACS 40 ml / 10% 叠氮钠溶

提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

免疫组织化学技术是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代，悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

免疫荧光通过抗体与示踪物质结合，利用抗原-抗体结合反应，进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。免疫荧光与免疫细胞化学比较方法优点缺点免疫荧光步骤较简单，可同时标记多种蛋白，图片伪彩色观赏性强荧光容易淬灭，样品保存时间不长免疫细胞化学样品适合长期保存步骤繁琐，一次只能标记一种蛋白

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及定量（荧光面积或平均荧光强度等）。

一、 样品 RNA 的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。2. 两相分离每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30 ℃ 孵育 2 到 3 分钟。4 ℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中

一、操作步骤：1. 蛋白样品制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：① 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。② 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。③ 按1ml