质粒转染法

一、转染

1. 从-70℃ 冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

2. 加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30 分钟后。

3.42℃ 水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

4. 向管中加入 1 mlLB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃ 振荡培养 1 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。

5. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃ 培养 16-24 小时。

6.在转染的同时应做两个对照：

对照组 1：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

二、转染大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5 mlLB 液体培养基中，37℃ 下振荡培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种于 100 mlLB 液体培养基中，37℃ 振荡培养 2-3 小时至 OD600＝0.5 左右。

2. 取上述培养液置于冰中 10 min，之后转移到已灭菌的 50 ml 离心管中再于冰上放置 5 min

3. 于 4℃ 离心，2700rmp，10 min，弃上清，收集细菌

4. 质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

三、质粒转染细胞株的建立

1. 准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 uL 无双抗完全培养基中接种 0.5~2×10⁵个细胞，转染时细胞融合度为 80 ~ 90% 。 

2．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用 50 uL Opti-MEM 稀释 0.8 ug 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 uL Opti-MEM 稀释 2.0 uL Lipofectamine TM2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4） 转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5） 将细胞板置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO₂ 孵育箱中继续培养 24 h 左右。

四、稳定转染细胞株的筛选

1.从 37℃，5％CO₂孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 ug/ml G418 的新鲜培养基，每 2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。

2.当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。

3.在细胞达到 60% 汇合率时再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选一次。

4.当细胞达到 90% 以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选。

5.直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

1.LB 培养基的配制：在 950 ml 去离子水中加入：胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl10 g，摇动容器直至溶质溶解。用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0，用去离子水定容至 1L，在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20 min。

2.LB 固体培养基及倒板：

（1）配制：100 mlLB 培养基加入 1.5 g 琼脂粉

（2）抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃ 的水浴中，待培养基温度降到 55℃ 时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50 μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）倒板：一般 10 ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15 分钟。

（4）保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃ 保存，一个月内使用。