🔥 质粒转化

感受态细胞易于接受外来基因成为重组细胞，实验将质粒加入有感受态细胞的培养皿中，热击处理进行质粒转化。

1. 材料

细胞株、质粒、链霉素、青霉素、FCS

PBS、胰酶、EDTA

转染试剂（Lipofectamine TM 2000）

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、NaCl

NaOH、氨苄青霉素、卡那霉素

质粒提取试剂盒、高压灭菌锅

42 ℃ 恒温水浴锅、恒温摇床、无菌培养板

消毒 1.5 ml 离心管、消毒枪头、无菌操作台

2. 试剂配制

（1）LB 培养基的配制：在 950 ml 去离子水中加入胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，摇动容器直至溶质溶解。用 5 mol/L NaOH 调 pH 至 7.0，用去离子水定容至 1 L，高压下蒸汽灭菌 20 min。

（2）LB 固体培养基及倒板：100 ml LB 培养基加入 1.5 g 琼脂粉，高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置于 55 ℃ 的水浴中，待培养基温度降到 55 ℃ 时（手可触摸），加入氨苄抗生素（终浓度为 50 μg/ml）。

一、转化

1. 从 -70 ℃ 冰箱中取 200 μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

2. 加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50 ng，体积不超过 10 μl），轻轻摇匀，冰上放置 30 分钟。

3. 42 ℃ 水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3~5 分钟。

4. 向管中加入 1 ml LB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37 ℃ 振荡培养 1 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）。

5. 将上述菌液摇匀后取 100 μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37 ℃ 培养 16~24 小时。

6. 在转染的同时应做两个对照：

（1）以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

（2）以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5 μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

二、转化大肠杆菌的扩增

1.从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3~5 ml LB 液体培养基中，37 ℃ 下振荡培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100~1:50 的比例接种于 100 ml LB 液体培养基中，37 ℃ 振荡培养 2~3 小时至 OD 600 ＝ 0.5 左右。

2. 取上述培养液置于冰中 10 min，之后转移到已灭菌的 50 ml 离心管中再于冰上放置 5 min。

3. 于 4 ℃ 离心，2700 rmp，10 min，弃上清，收集细菌。

4. 质粒的提取。准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液，按照说明书进行质粒提取。

5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）。 

三、质粒转染细胞株的建立

1. 准备细胞：转染前 24 h，在 500 μl 无双抗完全培养基中接种 0.5~2×10⁵ 个细胞，转染时细胞融合度为 80%~90%。  

2. 对于每个转染样品，按下面的方法准备： 

（1）用 50 μl Opti-MEM 稀释 0.8 μg 质粒 DNA，轻轻吹吸 3~5 次混匀，室温下静置 5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 μl Opti-MEM 稀释 2.0 μl Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3~5 次混匀，室温下静置 5 min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3~5 次混匀，室温下静置 20 min。注： 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37 ℃，5％ CO₂ 孵育箱中继续培养 24 h 左右。

四、稳定转染细胞株的筛选 

1. 从 37 ℃，5％CO₂ 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 μg/ml G418 的新鲜培养基，每 2~3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。

2. 当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。

3. 在细胞达到 60% 汇合率时再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选一次。

4. 当细胞达到 90% 以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选。

5. 直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。

1.LB 培养基的配制：在 950 ml 去离子水中加入：胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl10 g，摇动容器直至溶质溶解。用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0，用去离子水定容至 1L，在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20 min。

2.LB 固体培养基及倒板：

（1）配制：100 mlLB 培养基加入 1.5 g 琼脂粉

（2）抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃ 的水浴中，待培养基温度降到 55℃ 时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为 50 μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）倒板：一般 10 ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10-15 分钟。

（4）保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃ 保存，一个月内使用。