质粒转染大肠杆菌

【实验材料】细胞株 质粒； 【试剂、试剂盒】链霉素 青霉素 FCS PBS 胰酶 EDTA 转染试剂(Lipofectamine TM2000) 胰化蛋白胨 酵母提取物 琼脂 NaCl NaOH 氨苄青霉素 卡那霉素 质粒提取试剂盒； 【仪器、耗材】高压灭菌锅 42℃恒温水浴锅 恒温摇床 无菌培养板 消毒1.5ml离心管 消毒枪头 无菌操作台

一、转染 1. 从-70℃ 冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上 2. 加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30 分钟后。 3.42℃ 水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。 4. 向管中加入 1 mlLB 液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃ 振荡培养 1 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。 5. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃ 培养 16-24 小时。 6.在转染的同时应做两个对照： 对照组 1：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 二、转染大肠杆菌的扩增 1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5 mlLB 液体培养基中，37℃ 下振荡培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1：100-1：50 的比例接种于 100 mlLB 液体培养基中，37℃ 振荡培养 2-3 小时至 OD600＝0.5 左右。 2. 取上述培养液置于冰中 10 min，之后转移到已灭菌的 50 ml 离心管中再于冰上放置 5 min 3. 于 4℃ 离心，2700rmp，10 min，弃上清，收集细菌 4. 质粒的提取 准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳） 三、质粒转染细胞株的建立 1. 准备细胞： 贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 uL 无双抗完全培养基中接种 0.5~2×105个细胞，转染时细胞融合度为 80 ~ 90% 。 2．对于每个转染样品，按下面的方法准备： （1）用 50 uL Opti-MEM 稀释 0.8 ug 质粒 DNA，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 （2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 uL Opti-MEM 稀释 2.0 uL Lipofectamine TM2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 （3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。 （4） 转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。 （5） 将细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24 h 左右。 四、稳定转染细胞株的筛选 1.从 37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 ug/ml G418 的新鲜培养基，每 2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。 2.当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。 3.在细胞达到 60% 汇合率时再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选一次。 4.当细胞达到 90% 以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选。 5.直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后 15 天左右）。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。