质粒转染和提取的全步骤

以下是质粒转染和提取的全步骤：

质粒转染步骤：

1. 质粒DNA制备：首先从含有目标基因的质粒中提取质粒DNA。提取过程包括细胞裂解、质粒与染色体DNA分离、乙醇沉淀等步骤。

2. 转染试剂和培养基的准备：选择合适的转染试剂，如脂质体转染试剂、电穿孔转染试剂等。准备好宿主细胞，如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，并将细胞接种到合适的培养基中。

3. 转染操作：将质粒DNA与转染试剂混合，形成转染复合物。然后根据所选转染方法的要求，将转染复合物加入到宿主细胞中。转染方法有多种，如脂质体转染、电穿孔转染、微注射转染等。

4. 转染后培养：将转染后的细胞培养在适当的条件下，使质粒DNA进入细胞核并整合到宿主染色体上。

5. 筛选与鉴定：在转染后的细胞中筛选表达目标基因的细胞，并进行分子生物学鉴定，如PCR、Western blot、荧光显微镜观察等，以确认质粒转染成功。

质粒提取步骤：

1. 细菌培养：将含有质粒的细菌接种到含有抗生素的液体培养基中，如LB或SOC培养基。在适宜的温度下，如37℃，进行培养。

2. 收集细菌细胞：当细菌生长至对数生长期时，收集细菌细胞。

3. 裂解细菌：使用裂解液（如SDS-RNase缓冲液）裂解细菌细胞，释放质粒DNA。

4. 纯化

五、质粒转染

1.细胞计数后按一定数量植入24孔板中，放入培养箱中培养12小时，备用。

2.根据转染的孔数及每孔加入的质粒量算出所需的pbs量和质粒量

3.在两个10ml的离心管中均加入pbs液，A管加入质粒，B管加入转染试剂，吹打混匀。

4.在斡旋的条件下将转染试剂逐滴加入到质粒中，放置20分钟。

5.将加过转染试剂的质粒均匀加到已培养12小时的孔板中。再将孔板置于培养箱培养。

质粒提取

1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37℃恒温箱中摇菌过夜。

2. 将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。

同时取10mlP1溶液加入10μl的酶抑制剂，备用。

3. 在每个离心管中加入1mlP1：酶抑制剂（1：1），吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。

4. 加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。放置4分钟。一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。

5. 加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。冰上孵育20分钟。加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,细胞碎屑和SDS

6. 13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。

7. 待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。

8. 用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。

9. 加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13000r/min，30分钟。可见沉淀物，小心弃去上清。

10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后转入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，转入1.5ml的appendorf管。

11. 14600r/min，20分钟，弃上清，待乙醇蒸发后加入100μlTE，再将两管集合（酌量，若质粒量比较多，可加入200μl）。

12. 取2μl质粒液至加有98μl双蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外——分光光度计上检测质粒浓度和纯度。（纯度参照：1.8~2.0）

13. 剩余的质粒标记日期，质粒种类，浓度放在-20℃冰箱保存，备用。

质粒转染操作如下：

（1） 将离心消化后的细胞台盼蓝计数接种于六孔板中（我一开始预试使用的24孔板，正式实验因为需要较多的细胞，所以直接在六孔板里转染），每孔70万，间隔六个小时以后开始转染。（不同细胞接种数量不一样，密度要求达到80-90%，说明书上写的是70%-90%，但是事实上细胞密度高一些更好，间隔6个小时是自己摸索的条件，此时细胞已经完全贴壁，状态较好，细胞数量没有太大变化）（2） 配制转染试剂

① 125 μL OPTI-MEN +10 μL P3000 reagent+2.5 μg质粒， 混匀

② 125 μL OPTI-MEN + 5 μL Lipofectamine 3000，混匀③ 分别将①和②混匀，室温放置15min。3）转染将六孔板中的细胞更换新的培养基，加入③中转染试剂，混匀，37℃，5%CO2培养箱中感染5h。质粒的提取，菌液培养步骤如下：

①LB肉汤培养基制备：称取6gLB肉汤粉末，加入300mL已高压的超纯水，水浴溶解。121℃高压15min，4度保存。

②菌液制备：甘油菌加入到5mL LB肉汤培养基，在37℃、220rpm的恒温摇床孵育3h，再加入LB肉汤20 μL培养基至30mL，再在37℃、220rpm的恒温摇床孵育17-21h（实际操作孵育了20h，最好不要超过24h，否则细菌会老化），直至菌液呈浑浊状态（看不清离心管对面管壁）。③氨苄青霉素的制备：

称取0.5g氨苄青霉素粉末，置于15ml灭菌离心管中，加入4mL无菌水充分溶解定容至5mL，0.22um滤膜过滤除菌，小份分装，置于）2. 取5-15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min尽量吸 除上清。 （20μL甘油菌+30mL LB培养基（含25μg/mL氨苄青霉素））向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μL溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（500μL溶液P14. 向离心管中加入500 μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。（500μL溶液P25. 向离心管中加入700 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色 絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。 （700 μL溶液P3

质粒转染

注意:取两管感受态细胞:为空白对照，不加

质粒②:加入质粒;

每管加入量:体积<10μl，DNA<50ng;

质粒稀释成0.02μg/μl;

200μl感受态细胞中加入2μl浓度为0.02μg/ul质

粒。具体步骤:

1.取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰

上解冻，开启水浴锅42oc管1空白对照，不加质粒;管②加入2ul0.02μg/ul的质粒，混匀，冰上放

置30min2.42℃水浴90s，不摇3.取出，置冰上2min，加入LB 300ul，37℃200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。同时将选择性

培养基置于室温1小时。4.取上述转化菌液1502.将细菌分装在4个50ml的离心管中7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。同时取10mlP1溶液加入10ul的酶抑制剂，备用。3.在每个离心管中加入1mlP1:酶抑制剂(1:1)，吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。4.加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。放置4分钟。一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。GenomicDNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。5.加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。冰上

孵育20分钟。加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀，沉淀物包括genomicDNAProtein,细胞碎ul涂布在相应的培养板上(1)不含Amp的培养板--不含质粒菌液(2)含Amp的培养板一a:不加质粒菌液;b:加质粒菌液正面培养1h后，倒置培养过夜。5.观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5mlLB液体培养基中(加入Amp5ul)，37℃培养12h。

6.用含甘油30%的LB保存，-70℃备用(甘油消

毒、高压灭菌)。2、质粒提取

1.已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的Lb

夜总共大概150ml在37℃恒温箱中摇菌过夜。