流式细胞仪的使用步骤与规范

淋巴细胞、外周血的白细胞、流式细胞仪

FACS 缓冲液、 PBS 叠氮钠溶液

仪器缓冲液、 FACS 清洁液、 FACS 洗净液

一、细胞和试剂的准备

细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。

荧光标记单克隆抗体：常用的有 FITC（fluorescein -isothiocyanate）和 PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。

封闭抗体：抗 Fc 受体抗体 (注：如选择 REAfinity 重组抗体无需封闭，可省去此步骤)。

FACS 缓冲液：1xPBS  950 ml / FACS  40 ml / 10% 叠氮钠溶液 10 ml。

仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供。 

FACS 清洁液（FACS clean）：仪器厂家提供。

FACS 洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。

二、操作步骤

1. 单细胞悬液的制备：将 1x10⁵~1x10⁷ 的细胞放入 1.5 ml 离心管中 3000 r/min 离心 5 分钟，弃上清；加入 FACS 缓冲液 100 ul 悬浮细胞。

2. 封闭细胞表面 Fc 受体：在步骤 1 中加入 Fc 受体抗体 0.5 ul（0.5 mg/ml），水浴 3 分钟。

3. 细胞与荧光抗体结合：在步骤 2 中加入荧光抗体 1 ul（0.5 mg/ml），水浴 30 分钟。

4. 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤 3 中加入 FACS 缓冲液 350 ul，轻轻混匀，3000 r/min，离心 5 分钟，弃上清，重复步骤（4）2 次。

5. 上样前处理：取 100 ul 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入 FACS 专用管中，准备进行仪器检测和分析。

三、仪器的操作

（2）细胞的吸入：将装有细胞的 FACS 测定管放置到机器吸管孔处。先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入计算机中。

（三）使用后的清洗  

所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。将装 FACS 清洁液的 FACS 管放置机器吸管孔，高速吸入 1 分钟。将装 FACS 洗净液的 FACS 管放置机器吸管孔，高速吸入 1 分钟。再将装 FACS 清洁液的 FACS 管放置机器吸管孔，高速吸入 5 分钟。

同样再将装 FACS 洗净液的 FACS 管放置机器吸管孔，高速吸入 5 分钟。最后将一装有双蒸水的 FACS 管放置机器吸管孔后，关闭机器。将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。

1.  减少非特异荧光染色细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。

因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在 4 度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

如采用杂交瘤抗体，封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有 Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用 FACS 缓冲液洗 2～3 次，以除去游离的抗体。

如果选择 REAfinity 重组抗体就可以省去该封闭步骤，因为 REAfinity 重组抗体是将传统的杂交瘤来源的单克隆抗体的抗原结合区序列与人 IgG1 Fc 段序列结合，得到经过基因工程重组的抗体，为了消除流式分析中的背景信号，此段人 IgG1 Fc 序列经突变改造，使其不会对 Fcγ 受体产生非特性结合。

2.  单染色时以 FACS 最常用，FITC 标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

3.  如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。

流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，以在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物。因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪，是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。