流式细胞仪的原理及应用举例

免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。

流式细胞仪（flowcytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS），是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。

其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。

当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scatteredlight）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度（fluorescenceemissions）则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。

流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。

1. 免疫细胞群的分类静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如，B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。

2. 免疫细胞的分化发育免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。

3. 免疫细胞的分子表达免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。

4. 免疫细胞的分离如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如，最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。

1. 小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测

（1）简要说明

①细胞为小鼠胸腺细胞。

②抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。

（2）结果以点状二维图（dotplot）表示。横坐标为CD8分子，纵坐标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群，右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。

（3）结果分析胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况：
①存在着4种亚群：CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）。
②在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。

2. 小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成

（1）简要说明

①细胞为小鼠脾细胞

②抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体

（2）结果以点状二维图表示。横坐标为B220分子，纵坐标为CD3分子。因此，左上为T细胞群，右下为B细胞群。

（3）结果分析在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群—T细胞和B细胞。其中B细胞占60%左右，T细胞占30%。

3. 活化T细胞CD69分子的表达

（1）简要说明

①成熟T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下T细胞处于静止状态，而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。

②抗体为FITC标记的抗CD69抗体。

（2）结果以直方图表示。横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。

（3）结果分析在没有抗CD3抗体刺激时，绝大多数处于静止状态的T细胞不表达CD69分子（CD69+0.3%）；在2 μg/ml 抗CD3抗体刺激下，42.4%的T细胞表达CD69分子；在10 μg/ml 抗CD3抗体刺激下，54.3%的T细胞表达CD69分子。说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子，而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子，并且该分子的表达随着活化的强度而增加。因此，检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。

1. 减少非特异荧光染色

细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

2. 单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

3. 如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。