ELISA实验

一、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96 孔酶标板，4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后，用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封闭1 小时。

3. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 小时。

4. PBST 洗涤5 次后，加入100μl 稀释后的HRP 标记的二抗，37℃孵育1 小时。

5. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A405 吸收值。

二、包被细胞 

1. 在96 孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。

2. 第二天用PBS 洗涤培养板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀释）, 室温下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗涤培养板3 次，并晾干，储藏在2-8℃备用。

5. 用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封闭1 小时。

6. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 小时。

7. PBST 洗涤5 次后，加入100 μl 稀释后的HRP 标记的二抗,37℃孵育1 小时。

8. PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min 后，酶标仪上读取A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至100 ml。                                                                                                                    

ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：

 0.2M Na2HPO4 2.4ml

 0.1M 柠檬酸2.6ml

ddH2O 5ml

ABTS 5mg

H2O2(30%) 4 ul（用前加入）