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OD全称optical density,也就是光密度,也可以称为吸光度。吸光度指的是利用物质特有的吸收光谱,来鉴别物质或者测定物质的含量,也就是将一束特定波长的光通过被检测物,被检测物可以将光吸收掉一部分,通过吸光度计算被检测物的浓度。一般被检测物浓度越高,吸光度的值就会越高。实验中也是利用“OD值”和被检测物的浓度之间的关系来根据吸光度。
最需要注意的就是测量时的光波长。上文在介绍“OD值”概念时提到,吸光度利用的是物质特有的吸收光谱,实际操作中我们需要注意的最关键的也是这一点,不同物质的吸收光谱不同,最大吸收峰的波长也不同,为了达到最好的测量效果,一般来讲,我们需要在待测物质的最大吸收波长处来检测其“OD值”。例如,核酸在260nm波长处光吸收最大,而蛋白和酚类物质则在280nm波长处光吸收最大;BCA法检测蛋白含量时,显色反应后,溶液由浅绿色变为紫色,此时在560nm处有最大光吸收值;TMB法显色的ELISA实验,在加入终止液后溶液由蓝色变为黄色,在450nm处有最大光吸收。
除了吸收波长,一些实验还需要设置校正波长,校正波长往往远离最大吸收波长,作为本底吸收,排除由于气泡、灰尘等其他系统误差造成的“OD值”偏差。根据测得的“OD值”,进行双波长校正,可以有效的减少系统误差造成的影响。
对于测量得到的待测样本“OD值”还需要进行换算才可以得到最终的浓度,需要注意的地方也比较简单,就是根据对应试剂盒的说明书,采用推荐的曲线拟合方式进行拟合,拟合后需要看一下拟合曲线的R2值,约接近1证明曲线拟合度越高,结果越可信。如果R2值较低,则需要检查是否出现标准品稀释问题或实验操作出现失误。拿有些试剂盒来举例,BCA 蛋白定量试剂盒,此款试剂盒推荐的标曲拟合方式就是直线拟合,而ELISA试剂盒系列产品,则推荐用四参数拟合方式进行标曲拟合。选择错误的拟合方式,会影响曲线拟合度,R2值较低,回归计算的待测样品浓度也不准确。温馨提示:BCA蛋白定量实验以及ELISA实验的显色过程都是受反应时间及温度等条件影响的,需要根据实验情况及时终止实验进行读数,做实验时尽量不要走开。
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抗原包板的ELISA用于检测血样中抗体效价时,可以通过OD值进行分析。具体分析步骤如下:
准备一系列稀释的血清样品,例如1:10、1:20、1:40等等,以便进行效价曲线的绘制。
在包有抗原的ELISA板上加入不同稀释倍数的血清样品,每个样品要设置至少两个重复孔位。
加入与样品配对的二抗(一般是抗目标物种IgG或IgM的二抗),然后加入底物(如TMB或ABTS)。
在反应结束后,使用酶标仪测量各孔位的OD值,并以无血清样品为背景进行校正。
根据OD值的变化,绘制效价曲线。一般以血清稀释倍数为横坐标,OD值为纵坐标,绘制S型曲线,取效价中间区域(如1.5-2.5)的OD值平均数作为效价单位。
通过比较各样品对应的OD值和效价曲线,可以确定血清中抗体的效价。
需要注意的是,ELISA实验中的OD值受到多种因素的影响,如反应时间、温度、洗涤次数、试剂浓度等等。因此,应该在实验过程中控制这些因素,并使用合适的质量控制方法进行质量控制。
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