ELISA 实验

一、包被抗原1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96 孔酶标板，4℃放置过夜。2. 第二天弃去包被液后，用PBST 洗涤3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封闭1 小时。3. PBST 洗涤3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2 小时。4. PBST 洗涤5

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学

ELISA 的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。一，固相载体可作 ELISA 中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在 ELISA 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采

ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定 (Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay) 的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗

ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

PCR是从转录水平上检测目的基因,而非蛋白，从转录到翻译还有复杂的过程，因此基因的表达量与蛋白的表达量不一定是正相关的。WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到，ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说你可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响。基因翻译蛋白质，PCR可以检测基因的表达量，绝对定量和相对定量。但基因翻译表达蛋白质是个复杂的过程，有可能出现基因量大而蛋白质少，或者相

1、纳米金浓度的优化：选择最适合的纳米金浓度，以便于纳米金能够稳定地分散在化学物中，并有助于实现最佳连接效果；2、pH 优化可提高单克隆抗体的活性和稳定性；3、选择合适的交联剂：若采用商用的交联剂，可选择常用的 EDC/NHS 交联剂，极易促进纳米金和单克隆抗体的连接效果；4、选择高活性和高特异性的单克隆抗体，并保持适宜的温度。

可能原因：1）抗体孵育的时间或温度不够；2）显色反应时间不足；3）实验中使用的缓冲液的有问题。解决：1）适当增加抗体孵育时间，于 37℃ 进行孵育反应；2）适当延长显色反应时间；3）配置缓冲液确保使用三蒸水，排除其他离子的干扰。

1、加样不准：更换量程更加精确的枪，操作更加仔细；2、实验过程存在污染：更换样品，重复实验；3、底物配制时间过长：更换底物，现配现用；4、试剂失效：查询各试剂有效期，更换试剂；5、配制溶液的水不纯净：更换双蒸水。

1）将酶标仪读出的标准品的 OD 值以及标准品浓度导成 Excel 文档；2）将上述数据导入标准曲线绘制软件（Elisa 试剂盒推荐的软件），以浓度为「X」轴，OD值为「Y」轴；3）选择回归/拟合模型（如：直线回归），拟合后，观察 r2 的值，越接近 1，拟合效果越好；4）通过标准曲线计算样品浓度：从 Excel 表中粘贴检测样品的 OD 值导入软件，经模拟曲线自动计算生成对应的样品浓度。

Elisa 实验中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以作为捕获和检测抗体。一抗和二抗抗体识别的表位要有差异，两者物种来源一致，类别或亚类相匹配。抗体属性要与样品属性一致，比如样品是大鼠，则选大鼠来源的抗体。若自己包被 Elisa 抗体，则需要进入抗体公司网站首页（如 Thermo Fisher Scientific、Cell Signaling Technology 等），此处以 Thermo Fish

1、应及时开展效应实验；因为慢病毒敲低后，如果培养过长的话，细胞增殖过多，其生长状态会干扰实验结果。2、稳定株建立好后，可冻存多批代数较早的细胞，做效应实验时使用代数靠前的细胞，且传代次数不宜过多。一方面，细胞传代次数增加会使其理化性质改变，一些基因表型会丢失；另一方面，细胞多次传代后会使得干扰的基因收到代偿机制调节，促使干扰效果下调。3、若进行免疫相关的研究，建议慢病毒感染的稳定株，传代 2 次