🔥 ELISA 双抗体夹心法

ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）。

（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）。

（3）稀释液。

（4）终止液（2 M H2SO4）。

（5）底物缓冲液（pH 5.0）。

（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液。

（7）2，2＇-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液。

（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。

（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。

(1) 包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10 g/mL。在酶标板反应孔中加 0.1 mL，4 ℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min

(2) 加样：加一定浓度稀释的待检样品 (同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照） 0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，37 °C，1 h。用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min。

(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 （经滴定后的稀释度） 0.1 ml。 37 °C，0.5～1 h，用洗涤缓冲液洗板 3 次，每次 3 min。

(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入现配的 TMB 底物溶液 0.1 mL，37 °C，10～30 min。

(5) 终止反应：于各反应孔中加入终止液 0.05 mL。

(6) 结果判定：将酶标板在酶标仪上，于 450 nm (若 ABTS 显色，读 410 nm)，读数，输出到 Excel 中。