ELISA双抗体夹心法

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【原理】

ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原 结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。以检测HbsAg为例。

【材料】

酶标抗体(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待检血清

包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB

稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液

底物液 0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml，0.05 mol/L枸橼酸(10.5g/L)4.86 ml混匀，加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。

终止液 2 mol/L H2SO4

温箱、酶标反应板、酶标分光光度计

【方法】

1. 包被 取包被液适当稀释的抗HBS-Ig 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖，4℃ 24h。次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干。

2. 各孔内加不同稀释倍数的待检血清0.1 ml，同时加阳性和阴性对照血清，置43℃温箱60 min，移去液体。同前法洗涤3次，甩干。

3. 各孔内加稀释HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干。

4. 各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min。

5. 各孔内加2 mol/L H2SO4 0.05 ml，终止反应。

【结果】

1. 目测法 阳性孔呈桔黄色，阴性孔无色或极浅黄色。

2. 比色法 用酶标分光光度计测A492nm，计算P/N值(为待测血清A492nm和阴性对照A492nm的比值)。如P/N2.1，结果为阳性，否则为阴性。

ELISA简便、敏感、特异。并酶标记抗体试剂制备容易、稳定、有效期长、因此推广很快，ELISA双抗体夹心法，但仅适用于二价或二价以上的大分子 抗原的检测。