原理
将抗Tac特异性单克隆抗体Ab1吸附于固相载体，识别细胞培养上清或血清等标本中Tac并与之结合。应用辣根过氧化物酶标记的识别另一种Tac表位的特异性单克隆抗体Ab2识别固定于固相载体的Tac并与之结合。通过酶催化底物显色反映待检标本中游离Tac的水平。
材料与仪器
抗体 PHA
缓冲液 洗涤液 稀释液 终止液
塑料板 检测仪 水浴箱 冰箱 CO2孵箱 加样器
缓冲液 洗涤液 稀释液 终止液
塑料板 检测仪 水浴箱 冰箱 CO2孵箱 加样器
步骤
1. 刺激外周血单个核细胞（PBMC）
取外周血10 ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，加至24 孔细胞培养板，2×106 /孔，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司，37 ℃、5 ％CO2培养72 小时，收集上清，-20 ℃保存待测。同时设未加PHA对照组。可选用病人血清为待测标本。
2. Ab1包被
用0.05 M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆抗体（Ab1）稀释至5 μg/ml，加至ELISA板，100 μl/孔，4 ℃包被72 小时。
3. 封闭
1 ％BSA-PBS封闭，350 μl/孔，37 ℃孵育2小时。
4. 加样
ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激单个核细胞培养上清及对照组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024，每一稀释度取100 μl加至ELISA板。HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照，RPMI1640-10％FCS培养液为阴性对照。37 ℃，孵育2 小时，洗涤。
5. 加酶标抗体
于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗 Tac 特异性单克隆抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释100 μl。37 ℃孵育2小时，洗涤。
6. 加底物显色
各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃，孵育15 分钟。
7. 终止反应
各反应孔加2 ％氟化钠终止液50 μl。
8. 结果判定
首先肉眼观察反应孔内颜色，稀释梯度是否均匀。阳性、u性结果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔OD值（410 nm）。
取外周血10 ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，加至24 孔细胞培养板，2×106 /孔，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司，37 ℃、5 ％CO2培养72 小时，收集上清，-20 ℃保存待测。同时设未加PHA对照组。可选用病人血清为待测标本。
2. Ab1包被
用0.05 M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆抗体（Ab1）稀释至5 μg/ml，加至ELISA板，100 μl/孔，4 ℃包被72 小时。
3. 封闭
1 ％BSA-PBS封闭，350 μl/孔，37 ℃孵育2小时。
4. 加样
ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激单个核细胞培养上清及对照组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024，每一稀释度取100 μl加至ELISA板。HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照，RPMI1640-10％FCS培养液为阴性对照。37 ℃，孵育2 小时，洗涤。
5. 加酶标抗体
于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗 Tac 特异性单克隆抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释100 μl。37 ℃孵育2小时，洗涤。
6. 加底物显色
各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃，孵育15 分钟。
7. 终止反应
各反应孔加2 ％氟化钠终止液50 μl。
8. 结果判定
首先肉眼观察反应孔内颜色，稀释梯度是否均匀。阳性、u性结果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔OD值（410 nm）。
注意事项
1. 包被抗体活性要较高，否则影响本实验敏感性。
2. 经筛选比较，封闭液以1 ％BSA-PBS为好。
3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。
4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。
5. 如有条件，酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替，以增加实验的敏感性。
2. 经筛选比较，封闭液以1 ％BSA-PBS为好。
3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。
4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。
5. 如有条件，酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替，以增加实验的敏感性。
来源：丁香实验
