ELISA

图1：间接法测抗体示意图 间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是极微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM)，再经孵育洗涤后，加底物显色，底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法用同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗人球蛋白，

图1. 双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用

可能原因：1）抗体孵育的时间或温度不够；2）显色反应时间不足；3）实验中使用的缓冲液的有问题。解决：1）适当增加抗体孵育时间，于 37℃ 进行孵育反应；2）适当延长显色反应时间；3）配置缓冲液确保使用三蒸水，排除其他离子的干扰。

酶联免疫吸附试验，简称 ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。ELISA 是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此 ELISA 具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本

小鼠 SOD 测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。通过双抗体一步夹心法，在包被 SOD 抗体的 96 孔板中，加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，通过恒温培养箱温育并彻底洗涤。加入底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 SOD 正相关，用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1）将酶标仪读出的标准品的 OD 值以及标准品浓度导成 Excel 文档；2）将上述数据导入标准曲线绘制软件（Elisa 试剂盒推荐的软件），以浓度为「X」轴，OD值为「Y」轴；3）选择回归/拟合模型（如：直线回归），拟合后，观察 r2 的值，越接近 1，拟合效果越好；4）通过标准曲线计算样品浓度：从 Excel 表中粘贴检测样品的 OD 值导入软件，经模拟曲线自动计算生成对应的样品浓度。

采用两株识别不同表位的抗IL-8单克隆抗体，其中一株（4D7）作为包被抗体，以识别和结合待检标本中的IL-8，另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体的IL-8的另一个表位结合并催化底物显色。

竞争 ELISA 法是一种简便易行的亲和力测定方法。

先将康体包被于反应板上，加入待测抗原，然后再加入酶标康体，显色后即可测得抗原含量。

该技术是进行 ELISA 测定时，借用了免疫印迹技术的某些原理和方法，利用硝酸纤维素膜为固相载体，使抗原抗体反应在膜上进行，结合在硝酸纤维素膜上的酶抗体结合物通过将底物分解成不溶性的产物而沉积，在硝酸纤维素膜上形成斑点。待测抗原或抗体含量的高低可通过膜上斑点颜色的深浅来判断。

ELISA 法测定抗体效价用于检测不同抗原制备的免疫血清效价高低。

ELISA 法检测细胞凋亡是对凋亡细胞产生单/寡核小体进行高特异性、高敏感性的 定量检测。

ELISA 法是一种免疫测定技术，利用抗原抗体结合的手段，实现细胞或组织内生物活性物质的检测和定量。融合后的杂交瘤细胞可以产生大量相同的抗体，而细胞融合是一个随机的过程。在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需进行筛选和克隆化，而这种杂交瘤阳性克隆的筛选中，需对单克隆抗体进行检测，常用方法有酶联免疫吸附试验（ELISA），间接血凝试验（PHA），放射免疫测定（RIA）、直接和间接荧光抗

酶联免疫吸附实验（ELISA）测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 ELISA 实验测定细胞因子 IFN-γ。

BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）与亲和素（A）间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68 kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到

ELISA 是酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的简称。该方法自 20 世纪 70 年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA 分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争性 ELISA，其中每种方法根据检测试剂的不同又分为一些亚类，例如直接法分为酶标抗原的直接法和酶标抗体的直接法，双抗体夹心法又

实验所需「试剂」具体见「其他」1. 包被抗原用套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管小心吸取用包被液稀释好的抗原，沿孔壁准确滴加 0.1 ml 至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置 37℃ 过夜。2. 清洗快速甩动塑料板，倒出包被液。用另一根吸管吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。室温放 3 min，甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次。3. 加血淸用三根套有橡皮吸头的 0.2

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

ELISA 法评价肠道免疫功能是通过检测不同炎症蛋白如急性期炎症蛋白 MPO，血清淀粉样蛋白 SAA 或细胞因子如 IL-6，IL-1b 等的表达水平。

将抗μ链球蛋白（豚鼠抗兔IgM 抗体）非特异地吸附在固相上，加入待检乙脑病人血清，血清中的IgM 能和抗μ链球蛋白结合。当再加入定量特异性日本乙脑病（JBEV）抗原和酶标记的相应抗体（兔抗IBEV IgG）时，病人血清抗体再与IBEV 抗原和酶标抗IBEV IgG 结合作用于酶底物，酶底物显色反应，借此可测出血中IgM 抗体的含量。