原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）与亲和素（A）间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68 kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
材料与仪器
抗体
血清 亲和素
塑料板 检测仪 加样器 滴头 毛巾 洗涤瓶 烧杯 玻璃棒 试管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱
血清 亲和素
塑料板 检测仪 加样器 滴头 毛巾 洗涤瓶 烧杯 玻璃棒 试管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱
步骤
一、用于检测未知抗原的BA-ELISA
2. 加样
加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab
已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分钟。洗涤。
4. 加A-HRP
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分钟。洗涤4 次。
5. 底物显色
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定
目测或在ELISA比色仪上测OD值。
1. 包被抗原
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。
1. 包被抗体
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 分钟（简称洗涤，下同）。
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 分钟（简称洗涤，下同）。
2. 加样
加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab
已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分钟。洗涤。
4. 加A-HRP
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分钟。洗涤4 次。
5. 底物显色
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定
目测或在ELISA比色仪上测OD值。
二、检测未知抗体的BA-ELISA程序
1. 包被抗原
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。
2. 加样
加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab2
加稀释过的生物素化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分钟，洗涤。
加稀释过的生物素化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分钟，洗涤。
4. 余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。
注意事项
1. 反应物的浓度及比例
由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体（或第二抗体）的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性
生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性
亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4 ℃置2 个月或在-30 ℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附
亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度
由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37 ℃以20-30 分钟为宜。
由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体（或第二抗体）的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性
生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性
亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4 ℃置2 个月或在-30 ℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附
亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度
由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37 ℃以20-30 分钟为宜。
来源：丁香实验
