BA-ELISA

　　70年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术。由于BAS亲和力高,所以具有高灵敏度、高特异性和稳定性等优点，在现代生物免疫学领域中已得到广泛应用，并显示出明显的优越性。已报道有用于放射免疫、免疫荧光和免疫电镜等技术中，但应用更多的还是在酶免疫技术中。
　　BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据BAS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。为节省篇幅，兹只介绍BA-ELISA法。
　　(一)　原理
　　BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
　　(二)　操作步骤
　　方法一　用于检测未知抗原的BA-ELISA:
　　1.　包被抗体：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。
　　2.　加样：加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37℃孵育１小时，洗涤。
　　3.　加B-Ab：已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab)，加于每孔0.1ml,37℃孵育30～60分钟。洗涤。
　　4.　加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP)，于每孔加0.1ml，37℃孵育30～45分钟。洗涤4次。
　　5.　底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或OPD)底物应用液0.1ml，于37℃10～30分钟。再加2M H２SO４ 0.05ml以终止反应。
　　6.　结果判定：目测或在ELISA比色仪上测OD值(见ELISA部分)。